Periferik Kan Kaynaklı Hücrelerden Farklılaşan Nöral Hücrelerin İmmünofloresan Mikroskobu

Özet

Kaynak: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Kan Kaynaklı Nöronal Hücrelerin GM İçermeyen Üretimi. J. Vis. Uzm. (2021)

Video, floresan mikroskobu için yeniden programlanmış periferik kan hücrelerinden türetilen nöral hücrelerin hazırlanmasına yönelik bir protokolü gösterir ve immünofloresan görüntüleme yoluyla farklı hücre tiplerini ve gelişim aşamalarını gösterir.

Protokol

1. Kan kaynaklı nöral hücrelerin immünofloresan mikroskobu analizi
   1. Hücreleri 16 gün boyunca kültürleyin ve ortamı çıkarın.
      1. 75 mL steril su, 4 g paraformaldehitten oluşan önceden ısıtılmış fiksatif ile inkübe edin. Gerektiği kadar 10 N NaOH ekleyin ve çözelti temizlenene kadar karıştırın. Daha sonra 10 mL 10x PBS, 0.5 mL MgCl₂, 2 mL 0.5 M EGTA ve 4 g sükroz ekleyin. 6 N HCl ile pH 7.4'e titre edin ve 15 dakika boyunca 100 mL steril suya getirin.
      2. Sabitleyiciyi atın ve hücreleri her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Hemen taze yapılmış% 0.3 Triton X çözeltisi ekleyin ve hücrelere 5 dakika boyunca nüfuz edin. PBS ile 3 kez yıkayın ve PBS ve% 5 BSA tarafından yapılan bir engelleme solüsyonu ekleyin.
      3. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir külbütör plakası üzerinde bloke edin.
      4. % 1 BSA / PBS'de uygun antikor dilüsyonlarını hazırlayın ve hücreleri antikor dilüsyonları ile oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca bir külbütör plakası üzerinde inkübe edin. Hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, hücreleri DAPI ile inkübe edin ve mikroskopta görselleştirmek için lamellerin montaj ortamı ile monte edilmesi.
         NOT: Bu deneyde kullanılan doğrudan etiketli antikorlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-GFAP Cy3 konjugat	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
BSA Frac V 7.5	Gibco	15260037
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
Neurobazal Medium	Gibco	10888022
PBS steril	Roth	9143.2
Poly-L-ornitin	Sigma-Aldrich	P4957-50ML

%