Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanılarak Bir Doku Bölümündeki Amiloid Yapılarının Analiz Edilmesi

Özet

Kaynak: Nyström, S., et al., Hiperspektral Konfokal Mikroskopi ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme ile Lüminesan Konjuge Oligotikofenlerle Boyanmış Amiloid Dokularının Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, amiloid organizasyonunu yansıtan renk kodlu görüntülerde kompakt çekirdekleri mavi/yeşil ve kararsız çevre birimlerini kırmızı/sarı olarak ortaya çıkarmak için hFTAA boyası kullanarak floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu veya FLIM ile amiloid yapılarının analiz edilmesini göstermektedir.

Protokol

1. Doku Örneklerinin Hazırlanması

NOT: Amiloid belirteci olarak heptamer-formil tiyofen asetik asit (hFTAA) kullanılarak birçok doku tipi görüntülenebilir. hFTAA, agrega konformasyonuna duyarlıdır. Boyama, bu nedenle, tercihen, epitop maruziyeti olmayan bozulmamış agregalar üzerinde yapılmalıdır. Doku fiksasyonu minimumda tutulursa optimal spektral kalite elde edilir. Bu nedenle, boyama sırasında etanol içinde nazikçe sabitlenmiş taze donmuş malzeme tercih edilir. Bununla birlikte, , örneğin , formalin ile sabitlenmiş dokuda da amiloid birikintilerini tespit etmek mümkündür. hFTAA genellikle dokuya iyi nüfuz eder. Amaçlanan görüntüleme tekniği ile uyumlu bir numune kalınlığı seçin.

1. Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü bölümler kullanılıyorsa, gece boyunca ksilen içinde deparafinleştirilmelidir. Ardından, bölümleri her birinde 10 dakika olacak şekilde %99 etanol, %70 etanol, dH₂O ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içeren ardışık banyolara batırın. Doku bölümlerinin ortam koşullarında kurumasına izin verin.
   Dikkat: Ksilen her zaman kimyasal bir davlumbazda işlenir. Ksilen ve diğer organik çözücüler zararlıdır.
   1. Kriyoseksiyonları oda sıcaklığında çözdürün. Doku bölümlerini gece boyunca% 10 formalin içinde sabitleyin ve% 99 etanol,% 70 etanol,% dH₂O ve PBS, her birinde 10 dakika olmak üzere ardışık banyolara batırarak rehidre edin. Doku bölümlerinin ortam koşullarında kurumasına izin verin.
2. Kaplamak için doku bölümlerine hFTAA çalışma çözeltisinin damlacıklarını (yaklaşık 200 μL) ekleyin. Damlacık, yüzey gerilimi ile yerinde kalmalıdır. Boyama için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
3. Boyama solüsyonunu bir pipet kullanarak 500 μL PBS ile durulayın ve ardından slaytı 10 dakika PBS banyosuna daldırın. Bölümün ortam koşullarında kurumasını bekleyin.
4. Floresan montaj ortamını kullanarak monte edin. Montaj ortamının gece boyunca oturmasına izin verin.

2. FLIM
NOT: Konfokal mikroskop, bir floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ünitesi ile donatılmıştır.

1. Konfokal mikroskop için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: İğne deliği, 20; uyarma dalga boyu, 490 nm; lazer yoğunluğu, %0,5 (ortalama 7,5 μW güce karşılık gelir). 40 MHz'de darbeli lazerler kullanın.

2. FLIM yazılımında, 550 nm'nin üzerinde foton saymayı ayarlayın. Parametreleri görüntüle penceresinde, Maksimum sayı yaklaşık 4.000 foton sayısı olana kadar foton sayımını takip edin.

3. Dosyayı kaydedin ve tek foton sayma (SPC) görüntüsü olarak dışa aktarın.

4. Verileri FLIM yazılımında 2 bileşenli üstel bozunmaya sığdırın. χ² < 2 veren bir uyum iyidir. Y eksenindeki değer, verilen yaşam süresi için sayım sayısıdır.

5. Dahil edilecek sayımlar için bir eşik seçin, , örneğin , 100. T1'e göre renk kodu ve kullanım ömrü aralığını seçin. Bozunma, hFTAA'nın bağlı olduğu amiloid yapısına bağlıdır. 300 ila 1.000 ps arasında floresan ömürleri gözlemlenmiştir. Dosyayı kaydedin.

6. Dışa aktarma seçeneklerini kullanarak ham verileri dışa aktarın ve istediğiniz verileri yeni bir klasöre kaydedin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako Fluorescene montaj ortamı	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview system	ASI spektral imaging
Spectraview software	ASI spektral imaging<
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
FLIM system	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Tunable Laser In Tune	Zeiss

td style='width:160pt;'>