$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1.Live Görüntü Kaydı
1. Kültür WT ve CCR5-/- yeşil floresan proteini eksprese eden hipotalamik nöron hücreleri, 6 oyuklu plakada poli-D-Lizin ile önceden kaplanmış # 1.5 (veya 0.17 mm kalınlıkta) cam lamel üzerinde glikoz taşıyıcı 4 (GFP-GLUT4) etiketli glikoz taşıyıcı.
2. Forseps kullanarak nöronlu lamelleri dikkatlice çıkarın ve dikkatli bir şekilde cam slaytların üzerine yerleştirin.
3. Hassas görev mendilleriyle fazla ortamı/sıvıyı çıkarın. Mendilleri iki kez katlayın ve dikkatlice lamel üzerine yerleştirin. Lameli hareket ettirmeden mendilleri hafifçe bastırın.
DİKKAT: Lameli cam sürgüye kuvvetlice bastırmayın. Bu adımın amacı, kaldırma kuvvetinin neden olduğu görüntü alımı sırasında lamel hareket etmemesini/kaymamasını sağlamaktır.
4. Lamelleri ve slaytları, lamel aşağı bakacak ve düzgün bir şekilde sabitlenecek şekilde evrişim mikroskobu aşamasına yerleştirin. Bu adım, kullanıcıların aynı hedef hücre kümesini daha sonra izleyebilmeleri için kaydırma konumunun sabit kalmasını sağlamak içindir.
5. WT ve CCR5 - / - hipotalamik nöron hücrelerini 60x / 1.42 NA yağa daldırma objektif lensi ile gözlemleyin.
6. Seçilen hücre örneklerini bir dakika boyunca CCL5 (10 ng / mL) veya insülin (10 U / mL) ile tedavi edin.
7. Seçilen hücre örneklerini hemen görselleştirin ve kaydedin. Video kayıt yazılımını 30 dakika kayıt yapacak şekilde programlayın.
2. Dekonvolüsyon mikroskobu ve analizi
NOT: Protokolün bu kısmı, analiz için bir evrişim mikroskobu ve özel bir yazılımın kullanılmasını gerektirir.
1. Görüntüleme sisteminin gücünü açın, mikroskop aşamasının düzgün bir şekilde başlamasına izin verin ve ardından LED ışık kaynağını açın.
2. 60x 1,42 NA objektif lensine daldırma yağı (37 °C'de canlı numuneler için kırılma indisi 1,520) ekleyin. Numune slaytını, lamel objektif merceğe bakacak şekilde mikroskobun üzerine yerleştirin ve lamı düzgün bir şekilde sabitleyin.
3. Hedef hücreleri tanımlamak için parlak alan veya floresan aydınlatması kullanın. Hedef hücreler net bir şekilde gözlemlenene kadar odağı ayarlayın. Gereksiz çizik izlerini önlemek için objektif merceği lamel alanının dışına çıkarmayın.
4. Yeşil floresan proteini konjuge Glikoz Taşıyıcı 4'ü (GFP-GLUT4) GFP sinyali ile tanımlayın. Görüntü elde etmek için istenen hedef hücreleri belirleyin. Seçilen hedef hücre konumu ileride başvurmak üzere hafızaya alınabilir (bkz. Şekil 1).
5. Her hedef hücrede uygun deneysel parametreleri (piksel sayısı, uyarma dalga boyu, iletim yüzdesi, maruz kalma süresi, yığın kalınlığı, zaman aralığı ve toplam görüntüleme süresi dahil) ayarlayın. Bu deney için, GFP sinyalleri için görüntü piksel numarası 512 x 512 olarak ayarlandı (daha yüksek çözünürlük için 1,024 x 1,024 olarak ayarlanabilir). Pozlama süresi her 5 dakikada bir 0,025 ila 0,05 s arasında ayarlandı. Küçük yanal x, y ve z ayarlamaları önerilen yazılım tarafından kontrol edilebilir (bkz. Malzeme Tablosu).
6. Maksimum piksel yoğunluğunu elde etmek için pozlama parametresini yaklaşık 2.000 ila 3.000 sayıma ayarlayın. Floresan foto ağartmayı en aza indirmek için, maruz kalma süresini 1 saniyeden az tutarken uyarma ışığı iletim yüzdesini mümkün olduğunca azaltın. Her ek floresan kanal(lar)ı ve her bir ilgi alanı için bu adımları tekrarlayın.
7. Her hedef hücrede Z yığınının üst ve alt sınırını ayarlayın. Bu, mikroskop aşamasını hedef hücrenin üst ve alt kısımları hafifçe odak dışına çıkana kadar hareket ettirerek elde edilebilir. Kullanıcılar, üst ve alt sınır arasındaki görüntü sayısını ayarlayarak Z ekseninin çözünürlüğünü ayarlayabilir (bu, her görüntü arasındaki mesafeyi ayarlayarak yapılabilir).
8. Görüntü yığınları dekonvolvasyon yapıldı ve daha sonra ilgili yazılımın yardımıyla analiz edildi – bu durumda PerkinElmer'den Velocity.
