İmmünofloresan Kullanılarak Fare Hipokampal Dilimlerinde Sinapsların Mikroskobik Analizi

Abstract

Kaynak: McLeod, F., et al. Hipokampal Kemirgen Beyin Dilimlerinde Sinaps Yoğunluğunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, konfokal immünofloresan analizi kullanarak hipokampal beyin dilimlerinde sinaptik belirteçleri görselleştirmek için bir yöntemi göstermektedir. Dilimler, presinaptik ve postsinaptik belirteçleri hedef alan primer antikorlarla immün boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Etiketli belirteçler daha sonra sinaptik mimariyi kolokalizasyonları yoluyla değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirilir.

Protocol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Akut Hipokampal Dilim Hazırlama

1. Kafatasını kesmek için bir spatula ve keskin bir makas kullanarak fare beynini mümkün olduğunca çabuk çıkarın ve buz gibi, oksijenli (%95 O₂, %5 CO₂), yüksek sükroz yapay beyin omurilik sıvısına (ACSF, ~ 100 mL) yerleştirin.
2. Fare beynini bir Petri kabına yerleştirin ve beynin orta hattını kesmeden önce beyinciği ve frontal korteksin küçük bir bölümünü bir neşterle çıkarın.
3. İki yarım küreyi az önce kesilen tarafa yerleştirin ve her yarım küreyi bir vibratom sahnesine yapıştırın.
4. İlgilenilen bölgenin tamamının 200 - 300 μm kalınlığında kesitlerini kesin. Hipokampus durumunda, yarım küre başına yaklaşık 3-4 dilim elde edilmelidir.
5. Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak, dilimleri oksijenli (%95 O₂, %5 CO₂) ACSF'ye batırılmış bir odaya aktarın. 34 °C'de 30 dakika koruyun.
   NOT: Bu aşamada dilimler, rekombinant Dickkopf-1 (Dkk1) proteinleri gibi aktif farmakolojik ajanlarla, ajanlar dilim haznesine eklenerek tedavi edilebilir.
6. Bir boya fırçası kullanarak, dilimleri hazneden çıkarın, 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) %4 paraformaldehit (PFA)/%4 sükroz içinde 20 dakika ila 1 saat sabitleyin.
   Dikkat: PFA toksiktir, uygun koruma kullanın.
7. Dilimleri 1X fosfat tamponlu tuzlu suda üç kez yıkayın (PBS, her biri 10 dakika).
   NOT: Dilimler 1X PBS'de 4 °C'de tutulduğu sürece protokol burada 1 - 2 gün duraklatılabilir.

2. Sinaptik İşaretleyiciler için İmmünofloresans

NOT: Kullanılan tüm tamponların tarifleri Tablo 1'de bulunabilir.

1. Dilim kuyucuklarında, PBS'yi engelleme/geçirgenleştirme tamponu (Tablo 1) ile değiştirin ve RT'de 4 - 6 saat inkübe edin.
2. Poliklonal kobay antikorunu veziküler glutamat taşıyıcı 1'e (vGlut1) karşı blokaj/geçirgenlik tamponunda 1:2.000 seyreltmede seyreltin.
   NOT: vGlut1, pre-sinaptik uyarıcı terminal görselleştirme için bir belirteçtir. Sinaptik sonrası uyarıcı sinaps tanımlaması için, postsinaptik yoğunluk-95'e (PSD-95) karşı bir poliklonal antikor kullanın ve aynı çözelti içinde 1:500 oranında seyreltin. Her kuyucukta minimum 300 μL hacim kullanın. Hipokampusun anatomik konumunu tanımlamak için, mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) veya Tubulin gibi nöronal yapıyı da tanımlayabilen bir antikor kullanın. Tercih edilen sinaptik belirteçler (sinaptik öncesi ve sonrası) için tüm birincil antikorların doğru konsantrasyonlarını hesaplayın ve taze bloklama / geçirgenleştirici tamponda seyreltin.
3. Dilimleri primer antikor solüsyonunda gece boyunca (veya 1-2 gün boyunca) 4 °C'de inkübe edin. Güçlü hareket eden sallanan bir platform kullanın.
4. Dilimleri PBS'de üç kez yıkayın (her biri 10 dakika).
5. Blokaj tamponunda uygun ikincil antikorları 1:500 oranında seyreltin. Örneğin, vGlut1 kobay antikorunu kullanırken, spesifik bir floroforla konjuge edilmiş kobay bileşenini (örneğin, eşek anti-kobay) tanıyan ikincil bir antikor uygulayın. PSD-95 tavşan antikorunu kullanırken, farklı bir spesifik floroforla konjuge edilmiş tavşan bileşenini (örneğin, eşek anti-tavşanı) tanıyan ikincil bir antikor uygulayın.
6. Dilimleri bu çözeltide RT'de 2 - 3 saat inkübe edin. İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğundan dilimlerin ışıktan korunduğundan emin olun.
7. Dilimleri PBS'de üç kez yıkayın (her biri 10 dakika).
8. Bir boya fırçası kullanarak dilimleri 24 oyuklu plakadan dikkatlice çıkarın ve önceden etiketlenmiş cam slaytlara eşit şekilde yerleştirin. Her dilimin üzerine bir damla montaj ortamı ekleyin ve ardından dilimlerin üzerine nazikçe bir cam lamel yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşumundan kaçının. Yeterli montaj ortamı (300-400 μL) kullanmaya özen gösterin, çünkü yetersiz miktar kuru dilimlere neden olabilir.
9. RT'de en az 1-2 gün kurumaya bırakın ve slaytları ışıktan koruyun.
10. Slaytları kısa vadede 4 °C'de saklayın, ancak uzun süreli saklama için -20 °C'de saklayın.

3. Konfokal Görüntü Elde Etme ve Analiz

1. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntüleme.
   1. Görüntülenecek hipokampus bölgesini tanımlayın (örn. cornu ammonis 1 ve 3 (CA1, CA3) veya dentat girus (DG)) 10x veya 20x objektif vasıtasıyla.
   2. Sürekli nöritleri ve organize yapıyı tanımlayarak dilim anatomisinin sağlam olduğundan emin olmak için 40x veya 63x yağa daldırma hedefine geçin. Referans olarak MAP2 gibi bir nöronal belirteç kullanın (Şekil 1A).
   3. Ardından, 60x yağa daldırma objektifine geçin (sayısal diyafram [NA] = ~1,3 - 1,4) ve optimum sinyal ve kontrast elde etmek için her kanalın ayarlarını yapın. Herhangi bir pikselin doygunluğunu önlemek için her lazerin yoğunluğunu ayarlamak için yüksek/düşük kontrast seçeneği kullanın.
      NOT: Bu ayarlar kullanılan mikroskoba bağlı olacaktır, ancak lazer gücü ayarları için Malzeme Tablosuna bakın. En iyi sonuçlar için 1024 x 1024 piksel çözünürlük kullanın. Ayarlar, aynı deneyin farklı koşulları boyunca sabit kalmalıdır. Gerekirse ek yakınlaştırma uygulanabilir.
   4. Lekelenmenin eşit olduğu derinliği değerlendirin ve en az 8 eşit uzaklıkta (250 nm) düzlemlik görüntü yığınları elde edin. Ardından, dilim başına aynı ilgi alanından 3 bitişik temsili görüntü yığını alın.
      NOT: Derinlik bir dilimden diğerine değişebilir, ancak her zaman dilimin yüzeyinden yaklaşık 2 - 5 μm uzakta olmalıdır.
   5. Alımı, koşul başına en az 3 dilimde ve tedavi grubu başına 6 - 8 hayvanda tekrarlayın.

Tablo 1: İmmünofloresan boyama için kullanılan tamponlar.

KH₂PO₄

Engelleme/geçirgenleştirme Buffer	Konsantrasyon	Notes
Donkey serum	10%
Triton-X	0.50
PBS	1x
10x PBS		pH to 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/%4 Sucrose		pH to 7.4
PBS	1x	Dilute from 10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

%<td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>

Results

Tablo 1: İmmünofloresan boyama için kullanılan tamponlar.

Engelleme/geçirgenleştirme tamponu

Materials