1. Organotipik Dilimlerin Hazırlanması
NOT: Bu tarif, doğum sonrası 7-9. günde (p7-9) iki fare yavrusu kullanır ve altı oyuklu iki kültür kabına bölünmüş 24 organotipik dilim verir. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler steril bir başlıkta yapılmalı, nitril veya lateks eldiven kullanılmalıdır. Sadece hücre kültürü dereceli bileşenler kullanılmalıdır.
- Dilim hazırlama için otoklav şişeleri, diseksiyon aletleri (1 büyük makas, 1 küçük makas, 1 büyük düz spatula, 1 küçük yuvarlak ve keskinleştirilmiş spatula ve 1 forseps; ayrıntılar için Malzeme listesine bakınız), cam pipetler, pipet uçları ve mendil mendilleri kullanıldı.
- Cam pipetlerin yarısı geniş açıklık ile kullanılması gerektiğinden, dar ucunu kırın.
- Camın daralmaya başladığı noktanın hemen altındaki pipetin etrafını bir elmas kazıyıcı kalemle (varsa) çizin. Ardından, pipetin sivri ucunu bir nitril eldiven veya benzeri bir eldivene yerleştirin. Pipeti bir tezgaha doğru iterken bükerek ucu dikkatlice kırın.
- Ardından, kırık ucu bir parça zımpara kağıdına sürterek köreltin veya bir Bunsen brülöründe hafifçe eritin. Kırık pipetler, kesilen beyin dilimlerini aktarmak için kullanılır, kırık uç lastik ampule dönüştürülür ve büyük açık uç çözeltiye/dilimlere temas eder.
NOT: Bu steril bir başlıkta yapılmaz ve birkaç gün önceden yapılabilir.
- Kültür yemekleri hazırlayın.
NOT: Bu, dilimlemeden bir gün önce veya dilimlemeden en az 2 saat önce yapılabilir. - Politetrafloroetilen (PTFE) membranları ("konfeti") sterilize edin. Çevredeki mavi plastik parçalardan tek bir konfeti çıkarmak için iki steril forseps kullanın. Ardından, %96 etanol (EtOH) içeren bir Petri kabına iki kez daldırarak sterilize edin. Ardından, konfetileri kuruması için steril büyük bir Petri kabına düz bir şekilde koyun.
NOT: Konfetiler, kültür eklerindeki zarlara benzer hidrofilik PTFE zarlardır. Konfeti kullanımı canlı görüntülemeye yardımcı olur, çünkü konfeti forseps ile kaldırarak tek dilimler ekten mikroskop kurulumuna kolayca aktarılabilir (ayrıntılar için bkz. 4.8). Alternatif olarak, beyin dilimleri konfeti olmadan kültürlenebilir (burada dilimler doğrudan kültür ekinin zarına bağlanacaktır). Bu durumda, dilimi mikroskop banyosuna aktarmak için zar eki bir neşter ile kesilmelidir. - Altı oyuklu kültür kaplarının her bir oyuğuna 1 mL kültür ortamı ekleyin.
- Steril forseps kullanarak her oyuğa bir kültür eki yerleştirin. Ek parça ile kültür ortamı arasında hava kabarcıklarından kaçının.
NOT: Paradan ve çevreden tasarruf etmek için kültür eklerini yeniden kullanmak mümkündür. Bu, damıtılmış suda (dH2O) iyice durulama ve ardından yeniden kullanıma kadar en az 24 saat boyunca% 70 EtOH içinde inkübasyon yoluyla yapılabilir. Yeni bir kültüre hazırlanırken, ekleri ultraviyole (UV) ışık altında bir hücre kültürü plakasında 15-30 dakika kurutun. - Kültür eklerinin her birine iki (sterilize edilmiş ve kuru) konfeti yerleştirin. Minimum örtüşme elde etmek için konfetileri eklerin kenarlarına doğru yerleştirin.
- Plakaları 37 °C'de %5 CO2 ile hücre kültürü inkübatörüne koyun.
- Bioksit gazlı kabarcık soğuk diseksiyon ortamı (%95 O2/%5CO2). Solüsyonu steril tutmak için, tüpü gaz silindirinden steril bir şırınga filtresine (0,22 μm gözenek boyutu) bağlayın.
- Şırınga filtresinin diğer ucunu steril bir cam pipete bağlı steril bir tüpe bağlayın. Cam pipeti solüsyona yerleştirin, üzerini parafilm ile örtün ve gazı açın. Diseksiyon ortamını buz üzerinde tutun.
- Diseksiyon/dilimleme alanını hazırlayın.
NOT: İdeal olarak, bu prosedür steril bir başlıkta yapılmalıdır. Bu mümkün değilse, vibratom bir tezgah üzerinde bırakılabilir. Bu durumda saç filesi ve yüz maskesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak, dikdörtgen bir parça (yaklaşık 2 cm x 0,5 cm) agaroz jeli kesin ve uzun kenarı vibratom bıçağına bakacak şekilde vibratom aşamasına yapıştırın.
- Tüm yüzeyleri ve vibratom parçalarını %70 EtOH ile temizleyin ve otoklavlanmış mendil ile silin.
NOT: EtOH hücrelere zarar verebileceği için beyin dokusu ile temas edecek tüm parçaların tamamen kuru olması önemlidir. - Vibratoma steril bir tıraş bıçağı takın ve vibratomun bu işleve sahip olup olmadığını görmek için bir titreşim kontrolü yapın.
- Otoklavlanmış diseksiyon aletlerini, otoklavlanmış doku mendillerini, dört küçük Petri kabını, yuvarlak kenarlı bir neşteri, lastik ampullü iki cam pipeti, iki açık uçlu cam pipeti (bkz. pt. 1.1) ve süper yapıştırıcıyı (EtOH ile püskürtülmüş) davlumbaza yerleştirin.
- Kabarcıklı diseksiyon ortamını vibratom teknesine ve dört küçük Petri kabına dökün.
NOT: Bu adım sadece diseksiyondan hemen önce yapılmalıdır, çünkü bu noktadan itibaren ortam kabarcıklanmaz veya buz üzerinde tutulmaz.
- Beyinleri parçalara ayırın ve monte edin.
NOT: Sağlıklı dilimler elde etmek için bu adımın hızlı ve hassas bir şekilde yapılması gerekir. Biraz pratik yapmak gerekiyor. - Hayvan #1'i boynun çıkığı ile veya yerel yönergelere göre ötenazi yapın ve ardından büyük makasla kafasını kesin.
- Küçük, keskin bir makas kullanarak, boyundan buruna sagital bir kesi yaparak cildi hızlı bir şekilde çıkarın ve kafatasını ortaya çıkarmak için bir kenara çekin.
- Sagital sütür boyunca kesin, ardından frontal kemiklerin iç kısmı ve lamboid sütür (serebrum ve beyincik arasındaki sınır) üzerinde lateral kesiler yapılır.
- Kafatasını her iki taraftan bükmek için forseps kullanın. Beynin ventral tarafının altına yuvarlak, keskin bir spatula sokularak ve spatula yavaşça yanal olarak hareket ettirilerek kraniyal sinirler beyinden kesilir.
- Beyincikte koronal kesim rostral yapmak için tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın.
NOT: Bu kesim, dilimlerin kesilme açısını belirleyecektir. Bu nedenle düz bir açıyla yapılmalıdır. - Beyni kafatasından çıkarın ve bir diseksiyon ortamı içeren küçük bir Petri kabına çevirin.
- 1.6.1 adımlarını tekrarlayın. - 1.6.4. hayvan #2 için ve bu beyni ikinci bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Hayvanlar kısır değildir. Diseksiyonu başlığın bir tarafında gerçekleştirin ve ardından beyinler kafatasından çıkarıldıktan sonra diğer temiz tarafa geçin. - Eldivenleri değiştirin.
- Beyni vibratom aşamasına takın: monte edilmiş agaroz jelinin hemen önündeki sahneye ince bir süper yapıştırıcı tabakası ekleyin. Beyin #1'i büyük, düz bir spatula ile, taze kesilmiş (kaudal) tarafı spatulaya değecek ve ventral tarafı agaroz jeline bakacak (ve mümkün olduğunca yakın olacak) şekilde tutun.
- Ardından, beyni bir dizi forseps ile spatuladan iterek nazikçe yapıştırıcının üzerine yerleştirin. Beyin #2 için yeterli alan bıraktığınızdan emin olun.
NOT: Beynin sahneye iyi bir şekilde tutturulması, ancak aşırı yapıştırıcı olmaması önemlidir, çünkü bu, kesimi engelleyebilir.
- Beyin #1'i monte ettikten hemen sonra, beynin üzerine birkaç damla diseksiyon ortamı eklemek için büyük spatulayı kullanın. Bu, beyni nemli tutacak, yapıştırıcıyı sertleştirecek ve beynin yanlarına yapışmasını önleyecektir.
- 1.6.7 ve 1.6.8 adımlarını tekrarlayın. Beyin #2 için.
- Sahneyi vibratom teknesine takın.
- 1 - 1,5 mm genlik, 85 Hz frekans ve 0,2 mm/s hızla 230 μm kalınlığında koronal dilimler kesin. Bregma'ya yaklaşık 1,4 mm rostral ile 2,1 mm kaudal arasında dilimler toplayın.
- Her dilim kesildikten sonra açık uçlu cam pipetler kullanarak dilimleri toplayın (pt. 1.1). Dilimleri bir diseksiyon ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. Dilimleri iki parçaya bölmek için yuvarlak bir neşter kullanın ve iki yarım küreyi bölün.
- Tüm dilimler kesildiğinde, dilimleri kültür kaplarına yerleştirin.
- Kültür kabını (birer birer) kuluçka makinesinden çıkarın.
- Açık uçlu cam pipetleri kullanarak, konfetilerin her birine dikkatlice bir dilim aktarın.
NOT: Dilimler konfetinin ortasında düz bir şekilde durmalıdır. Bu biraz beceri gerektirir. Bununla birlikte, bazı dilimler mükemmel değilse, tüm dilimleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde inkübatöre sokmak önemli olduğundan, onları hareket ettirmeye çalışmak için zaman harcamaktan daha iyidir. - Dilime dokunmadan fazla ortamı nazikçe çıkarmak için bir cam pipet (sivri uç) kullanın.
NOT: Dilimler inkübasyon sırasında sıvıya batırılmamalıdır. Bu nedenle, fazla ortam, dilimler havaya maruz kalacak şekilde aspire edilmelidir (ince bir orta tabakası yine de dilimleri kaplayacaktır). Sıvıya batırılmış halde kalan dilimler genellikle sağlıksız olacak veya ölecektir (4 ve gözlemlerimiz). - Tüm konfetiler bir dilim olduğunda tabağı kuluçka makinesine geri koyun.
- 1.7.8 adımlarını tekrarlayın. - 1.8.4. Yemek #2 için.
- Kültür ortamını değiştirin.
NOT: Bu, dilimlemeden sonraki gün (in vitro 1. gün, DIV1) ve ardından her 2-3 günde bir yapılmalıdır. - Kültür ortamını bir su banyosunda veya inkübatörde önceden ısıtın.
- Steril bir başlıkta, her bir oyuktan kültür ortamını aspire etmek için vakumlu emme veya steril uçlu normal bir pipet kullanın. Bu, tabağı nazikçe eğerek (yaklaşık 30 derece) ve pipet ucunu kültür ekinin kenarına yerleştirerek yapılır.
- Her bir oyuktan yaklaşık 800 μL çıkarın (ek parçanın tabanını ortada kaplamaya yetecek kadar orta bırakın). Ardından, temiz bir pipet kullanarak, her bir oyuğa 800 μL önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Ardından, bulaşıkları hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.
2. Viral Transdüksiyon
- İlgilenilen bir plazmid ile Adeno-İlişkili Virüsler (AAV'ler) satın alın veya yapın.
NOT: Bu protokol, oligodendrosit mitokondriyi görselleştirmek için miyelin bazik protein promotörünün12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred veya AAV2/8 MBP_mito_GFP) transkripsiyonel kontrolü altında raportör gen olarak mitokondriyal hedefli dsred veya GFP taşıyan AAV serotip 2/8'in (AAV 2/8) kullanımını açıklar. Oligodendrosit sitoplazmasını görselleştirmek için genel CAG promotörü (AAV 2/8 CAG_GFP veya AAV 2/8 CAG_tdtomato) tarafından yönlendirilen raportör gen olarak GFP veya tdtomato taşıyan AAV 2/8 kullanılır. Böylece, AAV2/8 MBP_mito_dsred ile AAV 2/8 CAG_GFP kombinasyonu oligodendrositlerde kırmızı mitokondri ve yeşil sitoplazma verirken, AAV2/8 MBP_mito_GFP ve AAV 2/8'in birleştirilmesi yeşil mitokondri ve kırmızı sitoplazma CAG_tdtomato. Yapılar başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır13. - 7. günde in vitro (DIV7), AAV'li oligodendrositler transdüksiyona uğrar.
DİKKAT: AAV'lerle çalışırken güvenlik düzenlemelerine uyun. Uygun eğitime ve gerekli Biyogüvenlik Seviyesi onayına sahip olduğunuzdan emin olun. Aşağıdaki tüm noktalar, eldiven ve laboratuvar önlüğü kullanılarak Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Burada, dilimlerin korteks bölgesine AAV uygulaması anlatılmaktadır, çünkü bu en iyi iyileşmeyi gösteren alandır. - AAV'yi önceden ısıtılmış (37 °C) bir kültür ortamında seyreltin. Dilim içindeki tek hücrelerin görüntülenmesini sağlayan oligodendrositlerin seyrek transdüksiyonunu elde etmek için 2 × 109 genom kopyası/mL (GC/mL) civarında seyreltmeler önerilir. Bununla birlikte, spesifik deneyler için uygun olan dönüştürülmüş oligodendrositlerin yoğunluğunu sağlamak için farklı titreler kullanan bir pilot yapılmalıdır. İki farklı AAV kullanılıyorsa, bunlar aynı çözelti içinde karıştırılmalı ve aynı anda dilime eklenmelidir.
- Her dilime yaklaşık 1.3 μL seyreltilmiş AAV ekleyin. Pipet ucunun dışının kuru olduğundan emin olun. 1,3 μL seyreltilmiş AAV pipetleyin ve pipet ucuyla dilime dokunmadan (yaklaşık 1 mm uzakta) pipeti korteksin üzerinde mümkün olduğunca yakın tutun.
- Ardından çözeltiyi yavaşça pipetten dışarı itin. Solüsyon dilime dokunduğunda, solüsyonu tüm korteks alanına yaymak için pipet ucunu korteksin üzerine getirin.
NOT: Dilimleri gerekenden daha uzun süre kaputtan uzak tutmamak için bu prosedür mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. Bunu her seferinde bir tabakta yapın ve #2 tabağına başlamadan önce ilk tabağı tekrar kuluçka makinesine koyun. Dokuya zarar vermeden tatmin edici bir AAV dağılımı elde etmek için biraz pratik ve sabit bir el gerekir.
- Hücre laboratuvarında dik bir floresan mikroskobu mevcutsa, çanağı mikroskobun altına yerleştirerek kültürde geçen süre boyunca protein ekspresyonu kontrol edilebilir.
NOT: Çanak 2 - 5 dakikadan fazla kuluçka makinesinin dışında tutulmamalıdır.
3. Hızlandırılmış Görüntüleme
NOT: Görüntüleme, floresan işaretleyicilerin ekspresyon seviyeleri yeterli olduğunda ve dilimler sağlıklı göründüğünde gerçekleştirilebilir (genellikle DIV11-14).
- Mikroskop, perfüzyon ve ısıtmanın, kabarcıklı görüntüleme solüsyonunun ısıtılması ve banyoya girip çıkabilmesi için doğru şekilde ayarlandığından emin olun.
NOT: Banyo odaları için çeşitli çözümler mevcuttur. Burada basit bir versiyon sunulmaktadır. - Banyonun kenarlarına blu-tack/fun tack ile tutturulmuş körelmiş şırınga iğneleri (~ 45 ° 'de bükülmüş) ile banyonun içini ve çıkışını yapın.
- Borunun peristaltik pompa aracılığıyla sürekli kabarcıklı bir görüntüleme solüsyonu şişesinden, ısıtıcı ünitesinin ısıtma borusundan ve ardından banyodaki giriş şırınga iğnesine gittiğinden emin olun.
- Şırınga iğnesi çıkışına başka bir tüp bağlayın. Bu tüp daha sonra peristaltik pompadan geçer ve görüntüleme solüsyonu şişesine (veya bir atık şişesine) geri döner.
- Bioksit gazı ile kabarcık görüntüleme çözeltisi.
NOT: Bu, görüntülemeden en az 15 dakika önce başlatılmalı ve deney boyunca devam etmelidir. - Peristaltik pompayı ve ısıtıcıyı açın ve optimum banyo sıcaklığını (37 ± 0,5 °C) elde etmek için çözeltiyi banyodan geçirin. Sıcaklık ünitesine bağlı termometre sensörünün banyo solüsyonuna daldırıldığından emin olun.
- Mikroskobu, floresan lambasını ve uygun lazerleri açın.
- Numune için uygun bir ışık yolu ayarlayın.
NOT: Bu, mikroskop kurulumuna ve proba bağlı olarak değişecektir. Konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağına dair genel bilgi gereklidir ve burada ele alınmayacaktır. - Uygun büyütme ve sayısal diyafram açıklığına (n.a.) sahip bir suya daldırma objektifi kullanın. 40x suya daldırma plan-apokromat objektif (n.a. 1.0) kullanıyoruz.
- Hızlandırılmış video için yaklaşık 2 - 2,5 μm'lik bir optik kesit elde etmek için iğne deliği açın. Bu, hızlandırılmış çekim sırasında odak dışına çıkan mitokondri oluşumunu azaltır.
- Organotipik dilimi banyoya aktarın:
- Küçük bir plastik Petri kabına bir damla görüntüleme solüsyonu veya kültür ortamı ekleyin.
- Steril bir başlıkta, bir organotipik dilimi zar ekinden damlaya aktarmak için steril forseps kullanın. Forseps sadece konfetiye dokunmalı, dilime değmemelidir.
- Kapağı Petri kabının üzerine koyun.
- Dilimlerin geri kalanını içeren kültür kabını hemen inkübatöre geri koyun.
- Dilimi içeren bir Petri kabını mikroskoba getirin.
- Dilimi mikroskop banyosuna aktarırken peristaltik pompayı kapatın. İlk olarak, Petri kabından dilimli konfetileri banyonun tepesine kaldırmak için forseps kullanın (konfeti yüzecektir). Daha sonra forsettin iki ucunu konfetinin her iki tarafına, dilime dokunmadan konfetiye değecek şekilde yerleştirin ve konfetileri solüsyonun içinden banyonun dibine doğru itin. Konfetileri banyonun ortasında ortalayın.
- Dilime dokunmadan tutma ankrajını (arp) konfetinin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın.
NOT: Arp, dilimin banyoda yüzmesini veya sürüklenmesini önlemek için kullanılan at nalı şeklinde bir platin çapadır. Akut dilimler için, ince teller arpın bir tarafından diğerine uzanır (bir müzik arpına benzer). Organotipik dilimler için arp ipsiz olmalı ve konfeti boyutuna, dilime dokunmadan konfetinin üzerine uzanabilecek şekilde sığmalıdır. - Peristaltik pompayı tekrar açın.
- Hedefi örneğe kadar indirin.
- Görüntülenecek hücreyi ve bölgeyi seçin.
NOT: Hücre toksisitesine neden olabileceğinden hücrelerin lazer ışığına aşırı maruz kalmasından kaçının (aşağıdaki noktalardaki ipuçlarına bakın). - Doğru ifadeye sahip sağlıklı görünen bir oligodendrosit bulmak için göz merceklerini ve floresan lambayı kullanın. Tipik olarak, güçlü bir floresan proteini aşırı ekspresyonuna sahip oligodendrositler sağlıksız görünmektedir. Sağlıksız oligodendrositler, kabarcıklı bir görünüme sahip süreçlere sahip olacak ve mitokondri parçalanmış görünecektir. Sağlıklı oligodendrositlerde, soma ve süreçler pürüzsüz görünür ve mitokondri çeşitli uzunluklara sahiptir (tipik olarak nöronlar ve astrositlerden çok daha kısa olmalarına rağmen).
- İlgilenilen hücreyi görüş alanının ortasına yerleştirin.
- Ekrandaki hücreyi tanımlamak için yazılımdaki (Leica ve Zeiss mikroskopları için) "canlı" işlevini kullanın ve bir ilgi alanı seçin, örneğin, hücrenin birkaç birincil işlem veya miyelin kılıfı içeren bir kısmı veya tek bir işlem veya miyelin kılıfı.
NOT: Mümkün olduğunca çok işlemi/kılıfı görüntüleyebilmek için, x-y yönünde nispeten düz duran işlemleri içeren alanları seçin. - İlgilenilen alanı yakınlaştırın (tipik olarak 0,14 - 0,30 μm piksel boyutunda bir görüntü üretir).
- "Bölgeler" aracını kullanarak, alanın etrafına bir dikdörtgen çizin ve yalnızca seçilen bölgeyi tarama seçeneğini seçin. Tarama süresi ve dolayısıyla lazer pozlaması, yalnızca seçilen bölgenin taranmasıyla azaltılır.
NOT: Yatay dikdörtgen bölgeler, gereken taranan satır sayısının daha kısa olması nedeniyle dikey bölgelerden daha hızlı taranacaktır. Dikey bir dikdörtgen bölge taranırsa, tarama alanı 90 derece döndürülerek (döndürme aracı kullanılarak) tarama süresi azaltılabilir.
- Mitokondriyi iyi bir şekilde görmek için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın.
NOT: Gereken minimum lazer gücünü kullanın. Mümkünse, lazer gücünü artırmak yerine kazancı artırın. Hücre toksisitesine neden olmanın yanı sıra, çok yüksek lazer gücü zamanla görüntülenen nesneleri ağartacaktır, böylece tarama sırasında lazer gücünün daha fazla artmasını veya kazanmasını gerektirecektir. Gerekli lazer gücü ve kazancı, ekspresyon seviyesine ve mikroskoba bağlı olacaktır. LSM700 konfokal mikroskop ile dsred veya tdtomato'yu görüntülemek için 20-40 μW gücünde 555 nm lazer kullanıyoruz ve GFP'yi (objektifin arka açıklığında ölçülen lazer gücü) görüntülemek için 20 - 30 μW'de 488 nm lazer kullanıyoruz. Kazanç, canlı görüntüleme için yüksek, genellikle GFP için 700 - 800 ve dsred ve tdtomato için 850-980 aralığında ayarlanır. Yüksek kazanç, biraz daha fazla arka plan gürültüsüne neden olabilir ve bu da dijital ofset artırılarak kaldırılır (ofset değerleri genellikle 0 ile 15 arasındadır). Deneyimlerimize göre, MBP_mito_GFP kullanmak, MBP_mito_dsred'dan daha iyi bir sinyal-gürültü sağlar. - Tarama hızını seçin.
NOT: Yüksek bir tarama hızı kullanarak ve küçük bir tarama bölgesi çizerek tarama süresini en aza indirin (aşağıdaki 4.10.5 noktasına bakın). Çift yönlü bir tarama gerçekleştirerek tarama süresinden tasarruf etmek de mümkündür. Ancak, daha düşük görüntü kalitesi nedeniyle bu önerilmez. - Hızlandırılmış kaydın sıklığını ve süresini ayarlayın, örneğin oligodendrositlerde mitokondriyal görüntüleme için toplam 20 dakika boyunca her 2 saniyede bir görüntü yakalayın.
NOT: Frekans ve süre, ilgilenilen nesnelerin hareketliliğine göre ayarlanmalıdır. Daha yüksek bir frekans, numuneyi daha fazla lazer ışığına maruz bırakacaktır, ancak daha hızlı hareket eden nesneler de daha kısa bir toplam hızlandırılmış video süresi gerektirir (örneğin, oligodendrositlerdeki mitokondriden daha sık ve çok daha yüksek bir hızda hareket eden nöronlardaki mitokondri, tipik olarak her saniye toplam 2 dakika boyunca görüntülenir16). - Hızlandırılmış kaydı başlatın.
NOT: Mitokondri, kayıt sırasında odak dışına çıkabilir ve/veya görüntülenen bölgenin dışına kayabilir. Titreşimleri ve hareketi en aza indirmek için banyonun giriş ve çıkışlarını ayarlayın ve gerekirse pompa hızını azaltın. Odakta küçük değişiklikler genellikle hala meydana gelir. Bu nedenle, kayıt sırasında odakta küçük ayarlamalar yapılarak görüntüleme sırasında ekranın sürekli izlenmesi gerekir.
Hücrenin ve görüntülenen sürecin gelecekte tanımlanması için tüm hücrenin bir z yığınını yakalayın.
NOT: Daha iyi çözünürlük için, iğne deliği z-yığını için 1 havadar birime sıfırlanmalıdır.