Bir fare beyin dilimindeki bir bileşiğe doğru mikroglial süreç çekimini incelemek için iki foton mikroskobu

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
<

1. Parameters setting
   1. Multifoton sistemini açın (hibrit dedektörler, lazer, tarayıcı, elektro-optik modülatör, mikroskop).
   2. Lazeri 920 nm'de ayarlayın, lazerin mod kilitli olduğunu kontrol edin ve gücü %5 - %15'e ve kazancı %10'a ayarlayın. Bu, objektif altında 3 - 5 mW'lık bir güce karşılık gelir. Taranmamış dedektörlerin devrede olduğundan ve uygun emisyon ve uyarma filtrelerinin takılı olduğundan emin olun.
   3. Görüntüleme yazılımının parametrelerini aşağıdaki değerlere ayarlayın: çerçeve boyutu için, 295,07 x 295,07 μm'lik bir alana karşılık gelen 1024 x 1024 piksel; Yakınlaştırma için, 2. Sinyal çok gürültülüyse, hat ortalaması 2 olarak uygulayın. Piksel dinamikleri için görüntüleme yazılımını 12 bit veya daha fazla değere ayarlayın.
      NOTE: Daha yüksek bit değerine sahip görüntüler, araştırmacıların floresan yoğunluğundaki daha düşük bit değerine sahip görüntülerden daha küçük farklılıkları ayırt etmelerini sağlar: 8 bitlik bir görüntüdeki bir gri değerindeki bir değişiklik, 12 bitlik bir görüntüde 16 gri değerin ve 16 bitlik bir görüntüde 256 gri değerin değişmesine karşılık gelir. Bu nedenle, daha yüksek bitli görüntüler nicel analiz için daha uygundur, ancak boyutları bit derinliği ile arttıkça depolama kapasitesi ve bilgi işlem gücü sınırlayıcı hale gelebilir.
   4. 2 μm'de Z aralığı aralığı ve 2 dakikalık bir T aralığı ile XYZT tarama modunu seçin.
      NOTE: x,y ve z çözünürlüğü Nyquist örnekleme teoremi ile belirlenir. Mikroglia süreçlerini (<1 μm çapında) çözmek için yaklaşık 0.8'lik bir Z adım boyutu optimal olacaktır, ancak çoklu foton mikroskobunun optik çözünürlüğü sınırlayıcıdır (0.95 NA objektif ile 920 nm'de, eksenel çözünürlük yaklaşık 1 μm'dir). Bu fiziksel engelin üstünde, canlı görüntüleme deneyinde, hassasiyet veya sinyal-gürültü oranı, çözünürlük, hız ve toplam gözlem süresi önemlidir. Tüm bu parametreler dikkate alınarak, 2 μm'lik bir z adımı, 1024 x 1024 piksellik bir görüntü boyutu ve HyD dedektörlerine bağlı bir rezonans tarayıcı kullanılarak yüksek hızlı bir çekim (50 z planı elde etmek yaklaşık 15 saniye sürer) burada seçildi. Edinme sıklığı her 2 dakikada bir XYZT serisidir ve toplam süre 30 dakikadır. Kurulum yeterince hızlı veya hassas değilse, yanal çözünürlüğü (512 x 512'ye kadar) veya z dilimlerinin sayısını azaltmak mümkündür (yalnızca en güçlü floresan sergileyen z derinliğinde görüntüleme yaparak [i.e., floresansın soluk olduğu en derin z dilimleri değil]) veya tarayıcının hızını azaltmak için. Eksenel çözünürlük, z adımını 3 μm'ye kadar artırarak da azaltılabilir, ancak bu, nicelemeyi etkileyebileceğinden, karşılaştırılacak tüm deneyler aynı z adımı ile yapılmalıdır.
      NOT: CX3CR1creER-YFP farelerinden, yalnızca mikroglia'da genetik delesyonunu indüklemek için kullanılan ve mikroglia'nın yapısal olarak sarı floresan proteini (YFP) eksprese ettiği bir fare hattı olan dilimler üzerinde benzer deneyler yapmak mümkündür. Bununla birlikte, CX3CR1^GFP/+ fareler; Bu nedenle, görüntüleme mümkündür ancak zordur ve edinim parametrelerinin optimizasyonunu gerektirir. Bunları aşağıdaki gibi ayarlamanız önerilir.
   5. Lazeri 970 nm'de (YFP uyarımına 920 nm'den daha iyi uyarlanmıştır), gücü% 50'de ve% 50'de kazancı ayarlayın, bu da 5 - 6 mW hedefi altında bir lazer gücüne karşılık gelir.
   6. Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için hat ortalamasını 4 (veya daha fazla) olarak ayarlayın.
2. Dilimin ve cam mikropipetin konumlandırılması ve bileşiğin yerel uygulaması
   1. Kayda başlamadan 30 dakika önce peristaltik pompayı kayıt odasına bağlayın. Tüm perfüzyon sistemini 50 mL ultra saf su ile temizledikten sonra, kayıt odasının perfüzyonunu sürekli karbojenasyon altında bir cam beherde bulunan aCSF (50 mL) ile başlatın. Deney boyunca, sirküle eden aCSF'yi bir hat içi mikro ısıtıcı veya bir Peltier ısıtıcı ile 32 °C'de tutun.
      NOTE: Üst ve alt perfüzyonlu özel bir perfüzyon odası, dilimin her iki tarafındaki oksijenasyonu optimize etmek için tasarlanmıştır. Perfüzyon odası, aralarına gerilmiş bir poliamid ağ ile mükemmel şekilde uyan iki parçadan oluşur (Figure 1A,B). Dilimin doğrudan bir cam lamel üzerine yerleştirildiği diğer oda türleri ile karşılaştırıldığında, bu oda dilimin alt kısmındaki nöronal ölümü azaltır, canlılığı artırır ve şişmesinin neden olduğu dilim hareketlerini azaltır.
   2. Geniş ağızlı tek kullanımlık bir transfer pipeti ile, lens kağıdını çıkarmak için görüntülenecek beyin dilimini aCSF beherine aktarın, batmasına izin verin (hava kabarcığı takılı olmadığının bir kanıtı olarak) ve kayıt (perfüzyon) odasına aktarın.
   3. Perfüzyon akışı nedeniyle dilim hareketini en aza indirmek için dilimin üzerine bir dilim tutucu (iki dalı paralel naylon ipliklerle birleştirilmiş platinden yapılmış bir saç tokası) yerleştirin.
   4. Düşük büyütme hedefi (5X veya 10X) kullanarak ilgilenilen beyin bölgesini (pozlama süresi: 50 ila 80 ms) hedeflemek için parlak alan aydınlatmasını kullanın. Daha yüksek büyütme oranına (0,35x lensle 25x) suya daldırma objektifine geçin ve konumu ayarlayın.
      NOTE: Işığı engelleyebileceği ve dilimi yerel olarak deforme edebileceği için dilim tutucunun naylon ipliklerine yakın alanları görüntülemekten kaçının. İlgi alanının düz olduğundan emin olun. Gerekirse, dilimi ve/veya dilim tutucuyu yeniden konumlandırmak için dilim tutucuyu çıkarın.
   5. Sahada görüntülenecek floresan mikroglial hücreleri bulmak için floresan aydınlatmasını kullanın (maruz kalma süresi: 250 - 500 ms).
      NOT: Bu adım, araştırmacıların ilgilenilen bölgedeki hücrelerin varlığını ve floresan yoğunluğunu kontrol etmelerine ve hücresel kalıntı miktarını kontrol etmelerine olanak tanır.
   6. Pipeti ATP, 5-HT veya ilgilenilen ilacı son konsantrasyonunda 10 μL aCSF ile doldurun. Ucu aşağı doğru çevirin ve uçta sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için ilaçla dolu pipeti hafifçe sallayın.
      NOT: Enjekte edilecek çözelti kabarcıklar oluşturma eğilimindeyse, dahili filamentli borosilikat pipetleri kullanmayı düşünün. ATP'nin pipetten dışarı sızması, enjeksiyondan önce bile mikroglial süreçleri çekebilir (bu meydana gelirse, analiz adımında görünür olacaktır). Bu, kullanılan ATP konsantrasyonu ile orta düzeyde olsa da (500 μmol·L^-1), bu bir sorunsa, adım 1.2.6'da ATP (veya başka bir bileşik) çözeltisini eklemeden önce mikropipeti 2 mL aCSF ile önceden doldurmayı düşünün.
   7. Doldurulmuş pipeti, şeffaf boru ile 5 mL'lik bir şırıngaya bağlı bir pipet tutucusuna ve bir piston 5 mL konumuna yerleştirilmiş olarak monte edin. Pipet tutucunun kendisi üç eksenli bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiştir.
   8. Parlak alan aydınlatması altında, pipeti alanın ortasına yerleştirmek için mikro manipülatörü kullanın. Tekrarlanabilir ve optimum bir merkezleme için, görüntü üzerinde cetvelleri görüntüleyin ve kullanın.
   9. Pipeti yavaşça dilime doğru indirin, pipet ucu dilimin yüzeyine hafifçe temas edene kadar aynı anda hedefi kontrol edin ve ayarlayın. Dilime dokunulduğu görülür görülmez pipetin inişini durdurmak, pipet ucunun dilim yüzeyinin 80 - 100 μm'sine nüfuz etmesini sağlar (bkz. Figure 2B).
   10. Lazeri ayarlayın (yukarıdaki parametrelere bakın) ve mikroskobu çoklu foton moduna geçirin. Odanın herhangi bir ışık kaynağından (örn. bir bilgisayar ekranı) perdelendiğinden emin olun. Taranmamış dedektörleri açın ve kazancı ayarlayın. Görüntüdeki piksellerin doygunluğunu önlemek için renk kodlu bir üst sınıra sahip bir arama tablosu (LUT) kullanın.
   11. Görüntülenecek dilimin kalınlığını belirleyin (yani, floresanın tespit edilebildiği üst ve alt z konumları [genellikle toplamda 220 ila 290 μm arasında]).
       NOT: Dilimin yüzeyinde, dilimin iç kısmına kıyasla, genellikle alışılmadık bir morfolojiye sahip, artan bir işlem yoğunluğu ve muhtemelen mikroglia vardır. Bu birikim zamanla daha çarpıcı olacaktır (yani., görüntülenecek ilk beyin diliminden daha sonuncusunda daha görünür). Bu nedenle, ilk ~ 30 μm'deki z-düzlemleri analiz için kullanılmamalıdır ve hatta alım için atlanabilir.
   12. Toplam 30 dakikalık bir süre boyunca (veya istenirse daha fazla) kayda başlayın ve 5 dakikalık bir taban çizgisinden sonra, test edilecek bileşiği yerel olarak uygulayın (görüntülemeyi kesintiye uğratmadan). Bunu yapmak için, mikropipete bağlı şırınganın pistonuna 5 mL'den 1 mL konumuna (yaklaşık 5 saniye içinde) yavaşça bastırın. Pistona basarken direnç hemen hissedilmelidir. Aksi takdirde, uç kırılmış olabilir.
       NOTE: Eğitimli bir deneyci için, bu yöntemle yapılan enjeksiyonlar tekrarlanabilir, ancak bir şırınganın manuel manipülasyonuna alternatif olarak, pipet, verilen hacmin daha iyi kontrol edilmesini sağlamak için otomatik bir basınç çıkarma sistemine bağlanabilir. Enjeksiyon, enjeksiyon bölgesinde dilimde fiziksel bir bozulma yaratır. Bu distorsiyon, enjeksiyondan sonraki ilk iki veya üç görüntüde a posteriori olarak görülebilir, ancak dördüncü görüntüde (yani enjeksiyondan 8 dakika sonra) görünmemelidir. Devam ederse, pipet hazırlama parametrelerini değiştirmeyi düşünün.
   13. Alımın sonunda (30 dakika), mikropipeti atın ve dilimi çıkarın.
   14. Yeni bir dilimi görüntülemeye başlamadan önce, mikrogliaların normal bir morfolojiye sahip olduğunu ve hareket ettiğini ve dolayısıyla dilimlerin sağlıklı olduğunu kontrol etmek için 2D filmi (bölüm 2.1) yapın.

2. Mikroglial Süreçlerin Çekiciliğinin Analizi

1. 2D projeksiyon ve kayma düzeltmesi
   1. Dosyayı açın (. LIF) Fiji ile birlikte.
   2. Gerekirse, bir alt yığın oluşturun (Image/Stacks/Tools/Make Substack) sadece ilgilenilen z-düzlemleri ile. Örneğin, elde edilmişlerse ancak analiz için kullanılmayacaklarsa dilimin yüzeyine karşılık gelen z-düzlemlerini (adım 1.2.11'den sonraki NOT'a bakın) ve floresan içermeyen en derin z-düzlemlerini hariç tutun. Son yığın genellikle 90 - 110 z dilimi (180 - 220 μm) içerir.
   3. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Z project function (Image/Stacks/Z Project") öğesini seçin ve Max Intensity z yığınının projeksiyonlarını her seferinde elde etmek için projeksiyon türü nokta.
   4. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>MultiStackReg plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg), seçme Action 1: Align ve Transformation: Rigid Body satın alma sırasında meydana gelmiş olabilecek hafif sapmaları düzeltmek için. Bu 2D filmi yeni bir dosya (.tiff) olarak kaydedin.
2. Veri işleme
   1. Bu yeni dosyayı Icy ile aç.
   2. Dairesel bir R1 ilgi alanı (ROI) (özellikle pipetin gölgesi ve enjeksiyon sırasında oluşan bozulma ile tanımlanır).
   3. Eklentiyi kullanın ROI intensity evolution ve üzerinden ortalama yoğunluğu ölçün R1'deki zaman.
   4. Sonuçları bir .XLS dosyasına kaydedin.
3. Sonuçların nicelleştirilmesi ve temsili
   1. Zaman içindeki mikroglial yanıtı ölçmek için, her zaman noktasında belirleyin.
      Then, sonuçlar mikroglial yanıtın kinetiği olarak veya belirli bir zaman noktasında temsil edilebilir (bkz. Figure 3).

Şekil 1: Arayüz bölmesi detayları. (A) Dilim tutucunun 3D baskısı için anahat. Tutucunun dış çapı 7 cm'dir. (B) Araştırmacıların dilimleri sıvı-hava arayüzünde tutmasını sağlayan naylon ağ (ok) ile arayüz dilim tutucusu. (C) Dilimlerin görüntülenmeden önce karbojene edilmiş (ok, hortumun köpürmesini gösterir) ve nemlendirilmiş bir ortamda tutulmasını mümkün kılan arayüz odası cihazı.

Şekil 2: Perfüzyon odası detayları. (A) 3D baskı için anahat. Perfüzyon odasının dış çapı 5.9 cm'dir. (B) Dilimi destekleyen naylon ağ (ok) ile perfüzyon odası, alttaki slayta temas etmesini engeller ve aCSF'nin üstünden ve altından akmasını sağlar. (C) İki fotonlu mikroskoptaki düzeneğin resmi. Bileşiği lokal olarak iletecek olan mikropipet sağda görülebilir (yıldız). (D) Pipet parlak alanda görüntülendi. Ölçek çubuğu = 60 μm.

Şekil 3: Mikropipetin dilimdeki konumu. Floresein (1 μM) ile doldurulmuş bir mikropipet ile bir görüntü yığınının (30 günlük bir hayvanın hipokampusunda) elde edilmesine örnek. Floresein, z ekseni (A) veya y ekseni (B) boyunca maksimum çıkıntılarda pipetin (yıldız) konumlandırılmasını mümkün kılar. B panelinde, floresan açısından daha sönük olmasına rağmen, pipet ucunun altında da mikroglia olduğuna dikkat edin. Bu resimli örnekte, projeksiyonlar için dilimin en yüzeysel kısmında çekilen görüntüler de dahil olmak üzere tam yığın kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = A panelinde 30 μm ve belirtildiği gibi (her derecelendirme = 50 μm) panelde B. Yığının z kalınlığı = 220 μm.

Şekil 4: Optimal olmayan deneylere örnekler. Bu dilimler görüntülenmeden önce 6 saatten fazla beklemiş ve üst yüzeylerinden itibaren görüntülenmiştir. (A) Çok fazla döküntü (kabaca yuvarlak, floresan parçacıklar, ancak düzensiz kenarlıklar; yıldızlar) ve "gür" mikroglia (oklar), yani çok sayıda ancak kısa süreçler içeren bir z-yığını örneği. Aksonal büyüme konilerine benzeyen büyütülmüş işlem terminallerine (ok uçları) dikkat edin. Yığının z kalınlığı = 220 μm. Diğer iki panel, (B) 1-30 z-düzlemi (z-kalınlığı = 59 μm) ve (C) 30-120 z-düzlemi (z-kalınlığı = 180 μm) ile aynı dilimin iki alt yığınını gösterir. Üst düzlemlerde (B panelinde gösterilmiştir), A panelindeki gibi büyük proses terminallerine ve döküntülere ek olarak, olağandışı büyük düz gövdelere veya çıkıntılara (yıldızlar) sahip mikroglia vardır. Daha derin düzlemlerde (C panelinde gösterilmiştir), enkaz veya düz nesneler yoktur, ancak hücreler gür (oklar) ve yoğunluk alışılmadık derecede yüksektir. Toplamda, bu gözlemler mikroglia'nın normal bir durumda olmadığını göstermektedir.