Golgi-Cox Metalik Boyama Kullanılarak Bir Fare Beyin Bölümündeki Nöronların Mikroskobik Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Louth, E. L., et al. Golgi-Cox yöntemini kullanarak kalın beyin bölümlerindeki nöronları görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, üst ve alt odak sınırlarını ayarlayarak ve üst üste binen görüntüleri yakalayarak Golgi-Cox lekeli kalın bir beyin bölümündeki nöronları görüntülemeyi göstermektedir. Ayrıntılı nöronal projeksiyonları sağlamak için birden fazla konum görüntülenir ve bunlar bir 3D temsil oluşturmak için birleştirilir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Emprenye Of Brains
   1. Potasyum dikromatı çözerek %1 (a/h) potasyum dikromat, %0.8 (a/h) potasyum kromat ve %1 (a/h) cıva klorürden oluşan Golgi-Cox çözeltisini yapın ve potasyum kromat yüksek kaliteli suda ayrı ayrı. Çözeltileri karıştırın, cıva klorürü ekleyin ve son çözeltiyi 1. derece filtre kağıdı kullanarak süzün. Solüsyonu bir aya kadar karanlıkta saklayın.
   2. %5 izofluran kullanarak fareyi uyuşturun.
   3. Fareyi başını keserek ötenazi yapın ve beyni hızla çıkarın.
   4. Beyni 17 mL Golgi-Cox solüsyonu içeren 20 mL'lik bir cam sintilasyon şişesine yerleştirin ve karanlıkta RT'de 25 gün inkübe edin.
   5. Beyni, 40 mL sükroz kriyoprotektan (0,1 M fosfat tamponunda %30 (a/h) sükroz, pH 7,4) içeren 50 mL'lik konik bir tüpe koyarak karanlıkta 4 °C'de 24 saat boyunca kriyoprotektifleyin.
      NOT: Aşağıdaki isteğe bağlı üç adım, bu aşamada beyni uzun süreli depolama için dondurmak için ana protokole alternatif olarak kullanılabilir.
   6. Kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş 200 mL izopentanın içine daldırarak tüm beyni dondurun.
   7. Donmuş beyni 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve karanlıkta -80 °C'de saklayın.
   8. Devam etmeye hazır olduğunuzda, beyni 40 mL sükrooz kriyoprotektan içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirerek ve 24 saat boyunca 4 °C'de karanlıkta tutarak çözün.
2. Brain Sectioning
   1. Beyni sakarozdan çıkarın ve beyinciği bir tıraş bıçağı kullanarak keserek ve beynin kalan kaudal ucunda düz bir kenar bırakarak bölümlere ayırmak için bloke edin.
   2. Agarı (suda %3 (a/v)) eriyene kadar ısıtın, ardından erime noktasının biraz üzerine çıkana kadar soğumaya bırakın.
   3. Beyni, kuyruk ucu aşağı bakacak şekilde tek kullanımlık küçük bir tartı kabına yerleştirin ve üzerini örtecek kadar yeterli miktarda eritilmiş agar ekleyin.
   4. Agar katılaştıktan sonra, fazla agarı beyni çevreleyen yaklaşık 2 - 4 mm kalacak şekilde kesin ve beyni, az miktarda etil siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak kuyruk ucu aşağı bakacak şekilde bir vibratom aşamasına yapıştırın.
   5. Vibratomun sahne alanını beyni kaplayacak kadar yeterli miktarda sükroz kriyoprotektan ile doldurun ve beyni 400 - 500 μm'lik bir dilim kalınlığında (incelenecek beyin bölgesine bağlı olarak) 86 Hz'lik bir titreşim frekansı ve 0.125 mm/s'lik bir bıçak ilerleme hızı kullanarak bölümlere ayırın.
   6. Küçük bir boya fırçası kullanarak, beyin bölümlerini, piyasada bulunan ağ tabanlı ekler içeren ve 0,1 M fosfat tamponunda 10 mL %6 (a/h) sakaroz, pH 7,4 ile önceden doldurulmuş 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının kuyusuna yerleştirin.
   7. Bölümleri karanlıkta 4 °C O/N'de inkübe edin.
3. Developing Brain Sections
   1. Beyin bölümlerini, ağ tabanlı ekleri kullanarak 0,1 M fosfat tamponu, pH 7,4'te 5 mL %2 (a/h) paraformaldehit (PBD) içeren yeni bir kuyucuğa aktarın. Bir rocker üzerinde kuluçkaya yatırın, karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca yavaşça hareket edin.
   2. Bölümler, 5 mL su içeren yeni kuyulara aktarılarak iki kez yıkanmalıdır. RT'de karanlıkta orta hızda hareket eden bir külbütör üzerinde 5 dakika boyunca yıkanmalıdır.
   3. Bölümleri 5 mL %2,7 (h/h) amonyum hidroksit içeren yeni bir kuyuya aktarın. Bir rocker üzerinde kuluçkaya yatırın, karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca yavaşça hareket edin.
   4. Bölümler, 5 mL su içeren yeni kuyulara aktarılarak iki kez yıkanmalıdır. RT'de karanlıkta orta hızda hareket eden bir külbütör üzerinde 5 dakika boyunca yıkanmalıdır.
   5. Bölümleri, orijinal satın alınan konsantrasyonunun 10 katı su ile seyreltilmiş 5 mL Fiksatif A içeren yeni bir kuyuya aktarın. Bir rocker üzerinde kuluçkaya yatırın, karanlıkta RT'de 25 dakika boyunca yavaşça hareket edin.
   6. Bölümler, 5 mL su içeren yeni kuyulara aktarılarak iki kez yıkanmalıdır. RT'de karanlıkta orta hızda hareket eden bir külbütör üzerinde 5 dakika boyunca yıkanmalıdır.
4. Beyin Bölümlerini Monte Etme
   1. Küçük bir boya fırçası kullanarak bölümleri mikroskop slaytlarına monte edin. Cımbız ve küçük bir mendil kullanarak, fazla suyu ve agarı çıkarın. Dehidrasyona devam etmeden önce tüm agarın çıkarıldığından emin olun.
   2. Bölümlerin RT'de yaklaşık 45 dakika (400 μm bölümler) veya 90 dakika (500 μm bölümler) kurumasına izin verin.
      NOT: Zamanlama ve uygun kuruluk seviyesi kritiktir ve ortam sıcaklığına ve nemine bağlı olarak her laboratuvarda belirlenmesi gerekebilir. Çok kısa bir kuruma süresi, sonraki dehidrasyon adımları sırasında slaytlardan bölümlerin düşmesine neden olur ve çok uzun bir kuruma süresi, bölümlerin çatlamasına neden olur. Bölümler, uygun kuruluk seviyesinde hala parlak görünecektir.
   3. Slaytları belirtildiği gibi Coplin boyama kavanozlarına yerleştirerek bölümleri kresil menekşe ile boyayın.
      NOT: Bu isteğe bağlı adım, nöronal çekirdekleri kresil menekşe ile boyamak için hiç dondurulmamış bölümler için kullanılabilir. Kresil menekşede inkübasyondan önce bölümlerin temizlenmesi ve yeniden sulandırılmasının, bölümler arasında eşit lekelenmeye ve düşük arka plana yol açtığını bulduk.
      1. 5 dakika boyunca temizleme maddesine yerleştirin. Bir kez tekrarlayın.
      2. 5 dakika boyunca %100 etanol içine koyun. Bir kez tekrarlayın.
      3. Suya% 95 etanol, ardından% 75 etanolü suya ve ardından her biri 2 dakika boyunca suya% 50 etanol koyun.
      4. 5 dakika suda bekletin.
      5. % 0,5 (a/h) kresil menekşe renginde 7 dakika suda bekletin.
      6. 2 dakika suda bekletin. Bir kez tekrarlayın.
   4. Slaytları belirtildiği gibi Coplin boyama kavanozlarına yerleştirerek bölümleri kurutun.
      1. Suya% 50 etanol, sonra% 75 etanolü suya ve ardından% 95 etanolü suya 2 dakika boyunca yerleştirin.
      2. 5 dakika boyunca %100 etanol içine koyun. Bir kez tekrarlayın.
      3. 5 dakika boyunca temizleme maddesine yerleştirin. Bir kez tekrarlayın.
         NOT: Bu dehidrasyon ve temizleme süreleri, bu el yazmasında anlatıldığı gibi fare beyinlerini işlemek için yeterlidir. Bununla birlikte, sıçanlar ve inek kuşları da dahil olmak üzere diğer türler için son temizleme adımının toplamda 15 dakikaya kadar uzatılması gerekebileceğini gözlemledik.
   5. Susuz bir montaj ortamı kullanarak lamel bölümleri.
   6. Slaytların RT'de karanlıkta en az 5 gün yatay olarak kurumasına izin verin.

2. Kalın Beyin Bölümlerinde

1. Lekeli Nöronları GörüntülemeGörüntü Yığınlarını Yakalama
   <
   1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Mikroskop ampulünü, kamerayı ve sahne denetleyicisini açın.
   2. Mikroskop yazılımını açın (örneğin, Neurolucida).
   3. Mikroskop sahnesine bir slayt yerleştirin.
   4. 1,25X 0,4 N.A. PlanAPO veya 4X 0.16 N.A. gibi düşük büyütme hedefi kullanarak beyin bölümünün 2D geniş açılı görüntüsünü yakalayın.
      1. Görüntüye odaklanın ve pozlama süresi ve beyaz dengesi dahil olmak üzere kamera ayarlarını yapın.
      2. Bölümde herhangi bir yere sol tıklayarak bir referans noktası oluşturun
      Görüntü alma penceresinde "tek görüntü al"ı seçerek görüntüyü yakalayın.
   5. 10X 0.3 NA UPlan FL N objektifi kullanarak ilgilenilen nöronları içeren alanın orta çözünürlüklü görüntü yığınlarını yakalayın.
      1. Görüntüye odaklanın ve pozlama ve beyaz dengesi dahil olmak üzere kamera ayarlarını yapın.
      2. Bölümün en üstüne odaklanarak ve görüntü alma penceresinde "yığının üstü"nün yanındaki "set"i seçerek ve ardından bölümün altına odaklanarak ve görüntü alma penceresinde "yığının altında"nın yanındaki "set"i seçerek görüntü yığınının üst ve alt sınırlarını ayarlayın.
      3. Görüntü alma penceresinde "görüntüler arasındaki mesafe"nin yanına "5 μm" girerek adım mesafesini 5 μm olarak ayarlayın.
      4. Görüntü alma penceresinde "görüntü yığını al"ı seçerek görüntü yığınını yakalayın.
      5. Tüm görüntü yığınlarının X ve Y eksenlerinde en az %10 oranında örtüştüğünden emin olarak, tüm ilgi alanını yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
   6. 30X 1.05 NA silikon yağına daldırma hedefi kullanarak ilgilenilen nöronu içeren alanın yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarını yakalayın.
      1. Slayta 3 - 4 damla silikon daldırma yağı uygulayın ve objektifi slaydın üzerine yerleştirin, objektif ile yağ arasındaki teması sağlayın.
      2. Görüntüye odaklanın ve pozlama ve beyaz dengesi dahil olmak üzere kamera ayarlarını yapın.
      3. Bölümün en üstüne odaklanarak ve görüntü alma penceresinde "yığının üstü"nün yanındaki "set"i seçerek ve ardından bölümün altına odaklanarak ve görüntü alma penceresinde "yığının altında"nın yanındaki "set"i seçerek görüntü yığınının üst ve alt sınırlarını ayarlayın.
      4. Görüntü alma penceresinde "görüntüler arasındaki mesafe"nin yanına "1 μm" girerek adım mesafesini 1 μm olarak ayarlayın.
      5. Görüntü alma penceresinde "görüntü yığını al"ı seçerek görüntü yığınını yakalayın.
      6. Tüm görüntü yığınlarının X ve Y eksenlerinde en az %10 oranında örtüştüğünden emin olarak, tüm ilgi alanını yakalamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
   7. Veri dosyasını ve tüm görüntü dosyalarını harici işleme için TIFF formatında kaydedin.
2. Z-projeksiyon Görüntüleri ve Görüntü Montajları Oluşturma
   1. ImageJ'de Z-projeksiyon görüntüleri oluşturun
      1. Bio-Formats eklentisinin yüklü olduğu ImageJ yazılımını açın.
      2. "Eklentiler" -> "Biyo-Formatlar" -> "Biyo-Formatlar İçe Aktarıcı"yı seçin.
      3. Açılacak görüntü yığını dosyasını seçin.
      4. Dosya açıldıktan sonra, "Görüntü" -> "Tür" -> "RGB Rengi"ni seçerek formatı RGB olarak değiştirin.
      5. "Image" -> "Stacks" -> "Z Project..."i seçerek Z-projeksiyonunu oluşturun.
      6. İki boyutlu Z-projeksiyon görüntüsünü TIFF dosyası olarak kaydedin.
   2. Tüm ilgi alanının iki boyutlu bir görüntü montajını oluşturun.
      1. Yazılımı açın (örneğin, Adobe Photoshop).
      2. "Dosya" -> "Otomatikleştir" -> "Fotoğraf Birleştir"i seçin.
      3. "Gözat"ı seçin ve ardından birleştirilecek tüm görüntü dosyalarını ekleyin.
      4. "Blend Images"ın seçili olduğundan emin olun ve ardından "OK"u seçin.
      5. Tüm ilgi alanının elde edilen montaj görüntüsünü bir TIFF dosyası olarak kaydedin.

Malzemeler