Fare Beyin Bölümlerinde Hipokampal Nöronal Aktivasyonun Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Provenzano, G., et al. Nörogelişimsel Bozuklukların Bir Fare Modelinde Mekansal Öğrenmeden Sonra Hipokampal Nöron Aktivitesinin İmmünohistokimyasal Görselleştirmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, hipokampal nöronal aktivasyonu görselleştirmek için immünohistokimyasal görüntülemeyi göstermektedir. Lekeli beyin bölümleri, parlak alan mikroskobu altında daha koyu bölgeleri ortaya çıkarır ve bu da aktive nöronları gösterir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. İmmünohistokimya

1. Her fare için 3-5 dorsal hipokampal bölümü, her kuyucuk için 500 μl 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 24 çok kuyulu plakaya aktarın.
2. Her bir kuyucukta bulunan bölümleri 500 μl 0.1 M PBS ile yıkayın (5 dakika, hafifçe çalkalayarak 3 kez).
3. Endojen peroksidaz aktivitesini% 1 hidrojen peroksit (H₂O₂) ) içinde 20 dakika boyunca PBS'de hafif çalkalama ile inkübe ederek söndürün.
4. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
5. Dokunun geçirgenliği: PBS'de% 0.2 Triton X-100 içinde 5 dakika boyunca bölümleri inkübe edin.
6. Yukarıdaki adımlar sırasında (1.4; 1.5), tüm deney için yeterli bloke edici tampon (PBS'de %10 Keçi Serumu ve %0.1 Triton-X100) yapın (bölüm sayısı x 100 μl x 3 adım).
7. NOT: İkincil antikorun (Ab) (biotin ile konjuge edilmiş) yapıldığı aynı türden serum kullanın.
8. Bölümleri bir bloke edici tamponda (100 μl / bölüm) oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca hafif çalkalama ile inkübe ederek antikorun spesifik olmayan bağlanmasını önleyin.
9. Bölümleri birincil Ab fosforile hücre dışı sinyal regüle kinaz (pERK) içinde inkübe edin, gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tampon içinde hafif çalkalama ile.
10. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
11. Biyotin (1:250) ile konjuge edilmiş ikincil Ab ile inkübe edin, bloke edici tamponda (adım 1.6'da kullanılanla aynı) seyreltin, hafif çalkalama ile RT'de 1 saat boyunca.
12. Avidin ve biotinin kompleksleşmesi için oda sıcaklığında en az 30 dakika gerektirdiğinden, avidin-biotin kompleksi (ABC) reaktifini aynı anda hazırlayın.
13. Üreticinin protokolüne göre gerekli hacimde ABC reaktifi hazırlayın.
14. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
15. ABC Reaktifi ile RT'de bölümleri 45 dakika inkübe edin.
16. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
17. Bir diaminobenzidin (DAB) çalışma çözeltisi hazırlamak için, DAB kanserojen ve teratojenik olduğundan, DAB içeren her adım çeker ocakta yapılmalıdır.
18. DAB çözeltisini plastik bir transfer pipeti ile yeni bir plakaya aktarın.
19. Bölümleri DAB çalışma solüsyonunu içeren plakaya yerleştirin ve bölümlere maksimum maruz kalmayı sağlamak için plakayı elinizle yavaşça döndürün.
20. Yeterli sinyal gelişene kadar (2-5 dakika) DAB reaksiyonunu mikroskopta izleyin.
21. Dokuyu 0.1 M PBS'de (3 x 5 dakika) yıkayarak reaksiyonu istenen renk yoğunluğunda durdurun.
22. Çeker ocakta kalan DAB substrat solüsyonunu gece boyunca devre dışı bırakmak için ağartıcı kullanın ve laboratuvar yönergelerine göre atın.
23. Bölümleri PBS'de yüzdürerek jelatin kaplı slaytlara monte edin. Daha sonra oda sıcaklığında en az 3-4 saat kurutun.
24. Bölümleri sırayla %50, %70, %95 ve %100 etanol içinde 2 dakika kurutun ve %100 ksilen içinde 5 dakika temizleyin.
25. Montaj ortamı kullanarak lamel yapın ve gece boyunca kuruması için bir davlumbaz içinde bırakın.

Malzemeler