Fare Beyin Bölümlerinde Hipokampal Nöronal Aktivasyonun Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Provenzano, G., et al. Nörogelişimsel Bozuklukların Bir Fare Modelinde Mekansal Öğrenmeden Sonra Hipokampal Nöron Aktivitesinin İmmünohistokimyasal Görselleştirmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, hipokampal nöronal aktivasyonu görselleştirmek için immünohistokimyasal görüntülemeyi göstermektedir. Lekeli beyin bölümleri, parlak alan mikroskobu altında daha koyu bölgeleri ortaya çıkarır ve bu da aktive nöronları gösterir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. İmmünohistokimya

1. Her fare için 3-5 dorsal hipokampal bölümü, her kuyucuk için 500 μl 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 24 çok kuyulu plakaya aktarın.
2. Her bir kuyucukta bulunan bölümleri 500 μl 0.1 M PBS ile yıkayın (5 dakika, hafifçe çalkalayarak 3 kez).
3. Endojen peroksidaz aktivitesini% 1 hidrojen peroksit (H₂O₂) ) içinde 20 dakika boyunca PBS'de hafif çalkalama ile inkübe ederek söndürün.
4. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
5. Dokunun geçirgenliği: PBS'de% 0.2 Triton X-100 içinde 5 dakika boyunca bölümleri inkübe edin.
6. Yukarıdaki adımlar sırasında (1.4; 1.5), tüm deney için yeterli bloke edici tampon (PBS'de %10 Keçi Serumu ve %0.1 Triton-X100) yapın (bölüm sayısı x 100 μl x 3 adım).
7. NOT: İkincil antikorun (Ab) (biotin ile konjuge edilmiş) yapıldığı aynı türden serum kullanın.
8. Bölümleri bir bloke edici tamponda (100 μl / bölüm) oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca hafif çalkalama ile inkübe ederek antikorun spesifik olmayan bağlanmasını önleyin.
9. Bölümleri birincil Ab fosforile hücre dışı sinyal regüle kinaz (pERK) içinde inkübe edin, gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tampon içinde hafif çalkalama ile.
10. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
11. Biyotin (1:250) ile konjuge edilmiş ikincil Ab ile inkübe edin, bloke edici tamponda (adım 1.6'da kullanılanla aynı) seyreltin, hafif çalkalama ile RT'de 1 saat boyunca.
12. Avidin ve biotinin kompleksleşmesi için oda sıcaklığında en az 30 dakika gerektirdiğinden, avidin-biotin kompleksi (ABC) reaktifini aynı anda hazırlayın.
13. Üreticinin protokolüne göre gerekli hacimde ABC reaktifi hazırlayın.
14. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
15. ABC Reaktifi ile RT'de bölümleri 45 dakika inkübe edin.
16. Bölümleri 0,1 M PBS'de hafif çalkalama ile yıkayın (3 x 5 dakika).
17. Bir diaminobenzidin (DAB) çalışma çözeltisi hazırlamak için, DAB kanserojen ve teratojenik olduğundan, DAB içeren her adım çeker ocakta yapılmalıdır.
18. DAB çözeltisini plastik bir transfer pipeti ile yeni bir plakaya aktarın.
19. Bölümleri DAB çalışma solüsyonunu içeren plakaya yerleştirin ve bölümlere maksimum maruz kalmayı sağlamak için plakayı elinizle yavaşça döndürün.
20. Yeterli sinyal gelişene kadar (2-5 dakika) DAB reaksiyonunu mikroskopta izleyin.
21. Dokuyu 0.1 M PBS'de (3 x 5 dakika) yıkayarak reaksiyonu istenen renk yoğunluğunda durdurun.
22. Çeker ocakta kalan DAB substrat solüsyonunu gece boyunca devre dışı bırakmak için ağartıcı kullanın ve laboratuvar yönergelerine göre atın.
23. Bölümleri PBS'de yüzdürerek jelatin kaplı slaytlara monte edin. Daha sonra oda sıcaklığında en az 3-4 saat kurutun.
24. Bölümleri sırayla %50, %70, %95 ve %100 etanol içinde 2 dakika kurutun ve %100 ksilen içinde 5 dakika temizleyin.
25. Montaj ortamı kullanarak lamel yapın ve gece boyunca kuruması için bir davlumbaz içinde bırakın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24 oyuklu plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Slayt montajından önce dehidrasyon için etanol gradyanı yapmak için kullanılır.
Xylene<	66004-950	Toxic - kaputun altında kullanılacak. Kullanıma bağlı olarak her ay ksileni değiştirin.
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal keçi serumu	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	5 ml PBS hacmine 2 damla reaktif A ekleyin, karıştırın ve ardından 2 damla reaktif B ekleyin ve karıştırın.
DAB peroksidaz substrate	Vector Laboratories	SK-4100	5 ml çift distile su ekleyin: 2 damla tampon stok çözeltisi ve karıştırın; 4 damla DAB ve karıştırın; 2 damla hidrojen peroksit ve karıştırın.
pERK antikor	Cell Signaling Technologies	4370<
Biyotinile keçi anti-tavşan IgG antikoru	Vector Laboratories	BA-1000	Seyreltme 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Slaytlar için montaj ortamı. Eşdeğer montaj ortamı kullanılabilir.

td style='width:171pt;'>VWRtd style='width:311pt;'>Seyreltme 1:500