Organotipik Bir Fare Hipokampal Diliminde FRET Tabanlı Sensörler Kullanılarak Hücre İçi ATP Dinamiğinin Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Lerchundi, R., et. al. Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin FRET Tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK Kullanılarak Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, organotipik fare hipokampal dilimlerinde hücre içi ATP seviyelerini ölçmek için FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) tabanlı sensörlerin kullanımını gösterir ve fizyolojik ve deneysel koşullar altında nöronlarda ve astrositlerde ATP dinamiklerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. FRET tabanlı ATP Görüntüleme (Şekil 1)

1. Deneyden önce, E-ACSF'yi hazırlayın ve 7.4'lük bir pH elde etmek için en az 30 dakika boyunca %95 O₂/5% CO₂ ile köpürtün. Monokromatörün floresan ışık kaynağını (Xenon lamp) açın (Şekil 1). Dilimi inkübatörden çıkarmadan hemen önce perfüzyona başlayın.
   NOT: Tüm deney boyunca salini %95_O2 ve %5 CO₂ ile köpürtün.
2. Dilimi, peristaltik bir pompa kullanılarak sürekli olarak taze karbonjene E-ACSF ile perfüze edilen bir deney odasına aktarın (Şekil 1). Ardından, dilimi bir ızgara ile sabitleyin. Odayı mikroskop tablasına yerleştirin ve perfüzyon sistemini bağlayın. Perfüzyon için gaz geçirmez laboratuvar tüpleri önerilir.
   NOT: Deneyler, deney tasarımına bağlı olarak oda sıcaklığında veya fizyolojik sıcaklığa yakın bir sıcaklıkta gerçekleştirilebilir. Dokunun hareketinin neden olduğu odak değişikliklerini ve/veya kayma gerilimindeki değişiklikleri önlemek için perfüzyon akışının stabilitesini ve güvenilirliğini kontrol edin. Bizim tarafımızdan ve diğer birçok laboratuvar tarafından kullanılan dilim çalışması için standart perfüzyon hızları 1.5-2.5 mL/dk'dır.
3. Bir iletim ışığı kullanarak kültürlenmiş dilimi odağa getirin. Deneylerin yapılacağı alanı belirleyin (örneğin: hipokampusun CA1 bölgesi). Görüntüleme deneylerine başlamadan önce, dilimlerin tuzlu su koşullarına uyum sağlaması için en az 15 dakika bekleyin. Deney düzeneğinin konfigürasyonu için Şekil 1'e bakınız.
4. Kamerayı ve görüntüleme yazılımını açın. Ardından, uygun filtre küpünü seçin.
5. Donör floresan proteini (eCFP) 435/17 nm'de (~435 nm) uyarın. Pozlama süresini 40 ila 90 ms arasında ayarlayın.
   NOT: Dilimlerin floresan ışığına güçlü bir şekilde maruz kalması fototoksik etkilere neden olabilir.
6. 435 nm'de uyarma, hem 475 nm'de (eCFP; verici) hem de 527 nm'de (Venüs; alıcı) emisyona neden olur. Floresan emisyonunu 500 nm'de bir emisyon görüntü ayırıcı ile bölün ve verici ve alıcı floresansını daha fazla izole etmek için 483/32 ve 542/27'de bant geçiren filtreler kullanın. Güçlü ifade, dedektörlerin doygunluğuna neden olabilir. Bu durumda, uyarma yoğunluğunu azaltmak için nötr yoğunluk filtresi kullanabilirsiniz.
7. Arka plan çıkarma işlemi için hücresel floresan yok gibi görünen bir ilgi alanı (ROI) seçin. Ardından, hücre gövdelerini tanımlayan ROI'ler oluşturun.
8. Görüntü alma sıklığını ve genel kayıt süresini ayarlayın. Uzun (>30 dakika) deneyler için, fototoksisiteyi önlemek için 0.2-0.5 Hz'lik bir edinme frekansı önerilir.
9. Kaydı başlatın. Preparatın stabilitesini sağlamak için temel koşullar altında en az 5 dakika kaydedilmesi önerilir.
   NOT: Gerekirse kayıt sırasında hücrenin odağını ayarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: FRET görüntüleme kurulumunun yapılandırması. (A) FRET görüntüleme kurulumu için gerekli olan farklı bileşenlerin ve bunların uzamsal düzenlemelerinin şematik gösterimi. D...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-deoxyglucose	Alfa Aesar	L07338	Metabolize edilemeyen glikoz analogu
Bant geçiren filtreler 483/32	AHF Analysentechnik AG		Splitter uyumlu emisyon filtresi
Bant geçiren filtreler 542/27<		Splitter uyumlu emisyon filtresi
Işınayırıcı T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dikroik ayna
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dichroic<
OriginLab corporation		Scientific graphing and data analysis software
D-glukoz monohidrat	Caelo	2580-1kg<
DPBS	GIBCO/Life	14190250	Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suline
Eclipse E 600FN dik mikroskop	Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 dik mikroskop	Nikon Mikroskop Çözümleri
Experimental chamber	özel yapı		Canlı hücre görüntüleme
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	pH izleme için Fenol Kırmızısı ile
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic cell culture media	Monochromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ultra hızlı
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Water Immersion Microscope Objective
NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions		Görüntüleme yazılımı. FRET görüntüleme için yükseltilmiş sürüm
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Digital CMOS kamera	Perfusion tubing	Pro Liquid GmbH		Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0	Adobe		Görüntü işleme yazılımı
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich<	İnsan sinapsin 1 promotör fragmanı hSyn1'in kontrolü altında ATeam1.03YEMK ekspresyonunu indükleyen tek sarmallı AAV vektörü.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	İnsan glial fibriler asidik protein promotör fragmanı ABC1D'nin kontrolü altında ATeam1.03YEMK ekspresyonunu indükleyen tek sarmallı AAV vektörü.

td style='width:119pt;'>AHF Analysentechnik AGtd style='height:14.5pt;width:204pt;'>Veri işleme Origin Pro 9.0.0 (64- bit)td style='width:318pt;'> için perfüzyon odası monokromatör değiştirmetd style='width:106pt;'>v244