Bu video, organotipik fare hipokampal dilimlerinde hücre içi ATP seviyelerini ölçmek için FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) tabanlı sensörlerin kullanımını gösterir ve fizyolojik ve deneysel koşullar altında nöronlarda ve astrositlerde ATP dinamiklerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Organotipik Bir Fare Hipokampal Diliminde FRET Tabanlı Sensörler Kullanılarak Hücre İçi ATP Dinamiğinin Görüntülenmesi
734 görüntüleme
⸱
28 Nisan 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. FRET tabanlı ATP Görüntüleme (Şekil 1)
- Deneyden önce, E-ACSF'yi hazırlayın ve 7.4'lük bir pH elde etmek için en az 30 dakika boyunca %95 O2/5% CO2 ile köpürtün. Monokromatörün floresan ışık kaynağını (Xenon lamp) açın (Şekil 1). Dili....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1: FRET görüntüleme kurulumunun yapılandırması. (A) FRET görüntüleme kurulumu için gerekli olan farklı bileşenlerin ve bunların uzamsal düzenlemelerinin şematik gösterimi. D.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Metabolize edilemeyen glikoz analogu | ||||
| Bant geçiren filtreler 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter uyumlu emisyon filtresi | |||||
| Bant geçiren filtreler 542/27< | Splitter uyumlu emisyon filtresi | ||||||
| Işınayırıcı T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dikroik ayna | |||||
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic< | |||||
| OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | ||||||
| D-glukoz monohidrat | Caelo | 2580-1kg< | |||||
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suline | ||||
| Eclipse E 600FN dik mikroskop | Nikon Microscope Solutions | ||||||
| Eclipse FN1 dik mikroskop | Nikon Mikroskop Çözümleri | ||||||
| Experimental chamber | özel yapı | Canlı hücre görüntüleme | |||||
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | pH izleme için Fenol Kırmızısı ile | ||||
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media | Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra hızlı | |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |||||
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Görüntüleme yazılımı. FRET görüntüleme için yükseltilmiş sürüm | |||||
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS kamera | Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Görüntü işleme yazılımı | |||||
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich< | İnsan sinapsin 1 promotör fragmanı hSyn1'in kontrolü altında ATeam1.03YEMK ekspresyonunu indükleyen tek sarmallı AAV vektörü. | |||||
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | İnsan glial fibriler asidik protein promotör fragmanı ABC1D'nin kontrolü altında ATeam1.03YEMK ekspresyonunu indükleyen tek sarmallı AAV vektörü. |
