Kafatası İmplantı Kullanılarak Nöro-İmmün Dinamiklerin Floresan Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Bisht, K., et al. Farelerde nöro-immün dinamiklerin tekrarlayan in vivo görüntülemesini gerçekleştirmek için hassas beyin haritalaması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, kafatası implantı olan transgenik bir farede nöro-immün dinamiklerin floresan görüntülemesini göstermektedir. Vasküler ve nöronal stabilite, nöronal aktiviteye karşı immün yanıtları yansıtan dinamik mikroglial değişikliklerle birlikte görüntülenir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kraniyal pencere implantasyonu için fare hazırlığı

NOT: Floresan etiketli çeşitli transgenik fare çizgileri görüntüleme için uygundur.

1. Microglia'yı in vivo olarak görselleştirmek için CX3CR1GFP/+ fare kullanın. Tipik olarak, 17-25 g ağırlığındaki genç ila genç erişkin 4 ila 10 haftalık fareler kullanılır.
   NOT: Bu yaklaşım sütten kesilmeden önce fareler için bile uygun olsa da, fareleri beslenmek için anneleriyle birlikte kafeslerine geri döndürme ihtiyacı, annenin ameliyat sonrası yavrulara yeterli bakımı yapmaması durumunda iyileşmeyi zorlaştırabilir. Bu nedenle, sütten kesme sonrası farelerin kullanılması önerilir.
2. Anestezik bir odada izofluran (1 dakika boyunca indüksiyon için oksijende% 5 akış) kullanarak fareyi uyuşturun. Farenin ayak parmağı ve/veya kuyruk tutamlarına herhangi bir hareket veya seğirme tepkisi göstermediğini kontrol edin. Fareyi hazneden çıkarın ve açık havada, bir saç düzeltici kullanarak başın kulakları arasındaki tüyleri göz hizasından boyun bölgesinin tepesine kadar iyice tıraş edin.
   NOT: Kullanılan izofluran konsantrasyonu, indüksiyon odasının boyutuna bağlı olacaktır. Bu nedenle, daha küçük odalar için, anesteziyi etkili bir şekilde indüklemek için% 3-4 izofluran kullanılabilirken,% 5'e kadar ihtiyaç duyacaktır.
3. Fareyi anestezi için stereotaktik cerrahi istasyonu burun konisine taşıyın (ameliyat sırasında bakım için %1,5-2), kulak çubukları kullanarak başını sabitleyin ve vücut ısısını sıcak tutmak için fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.
4. Her iki gözünüzü de göz merhemiyle yağlayın. 100 μL% 0.25 bupivakain (fareye 8-12 saat sürecek lokal analjezi sağlamak için) ve 100 μL 4 mg / mL deksametazon (cerrahi prosedürden kaynaklanabilecek iltihabı azaltmak için) enjekte edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce farenin en az 5 dakika oturmasına izin verin.
5. Tıraşlı kafayı üç alternatif betadin ve %70 alkol ile temizleyin. Cerrahi bir bıçak veya makas kullanarak, kulaklar arasındaki kafatası bölgesinin arkasından gözler arasındaki ön bölgeye uzanan orta hat saçlı deri kesisi yapın. Kalan deri kafatasını ortaya çıkarmak için kesilir.
6. Kafa derisi ile alttaki kafatası arasında bulunan bağ dokusunu %3 hidrojen peroksit ile temizleyin (H₂O₂) ve stereotaktik koordinatlarla görüntülenecek beyin bölgesini lokalize edin.
   NOT: Kafatası yüzeyindeki kesiden sıklıkla bir miktar kanama olur (adım 1.5). Bu kanama genellikle 3-5 dakika içinde kendiliğinden düzelir. Peroksit ile temizlik yardımcı olur. Önceki bupivakain tedavisinin (adım 1.4) de bu süre zarfında kanama miktarını sınırladığı belirtilmektedir.

2. Fare kafatası penceresi implantasyonu surgery

1. Bir diş matkap ucu (0,7 mm uç çapı) kullanarak kafatasına ~4 mm'lik dairesel bir açıklık açın ve sivri forseps kullanarak kafatasının bu kısmını dikkatlice çıkarın. 6-8 haftalık farelerin somatosensoriyel korteksini görüntülemek için, kraniotominin merkezini -2.5 posterior ve ± 2.0 lateralde bregmaya yerleştirin. Delme sırasında, beyni soğutmak, kemik kalıntılarını temizlemek ve nihai olarak çıkarmak için kafatası kemiğini yumuşatmak için kafatasını steril salin ve pamuklu çubuklarla düzenli olarak nemlendirin.
   NOT: Kraniyotomi koordinatları, ilgilenilen bölgeye ve farelerin yaşına bağlı olarak değişecektir.
2. Kafatasını çıkardıktan sonra, kraniyotomiye tuzlu su ile nemlendirilmiş küçük bir kapak camı (0,1 ± 0,02 mm kalınlığında #0 boyut) dikkatlice yerleştirin. Steril bir mendil kullanarak fazla tuzlu suyu kurulayın.
3. Sivri uçlu bir aplikatör (pipet ucu veya kırık bir tahta pamuklu çubuk çubuğunun sivri ucu gibi) kullanarak, siyanoakrilat yapıştırıcıyı pencerenin etrafına uygulayın ve beyne ve kafatasına yapışmasına izin verin. Astar yapıştırıcısını kafatasının geri kalanına uygulayın ve 20-40 saniye boyunca bir kürleme ışığı ile kürleyin. Son yapıştırıcı ile pencerenin etrafında bir kuyu hazırlayın ve 20-40 s'lik bir kürleme ışığı ile sertleştirin.
4. Kraniotominin kontralateral hemisferindeki kafatasına önce astar yapıştırıcısı ile ve ardından son yapıştırıcı ile küçük bir kafa plakasını yapıştırın. Her ikisini de kürleme ışığı ile her biri 20-40 saniye kürleyin.
   NOT: Bu işlem sırasında kafatası yapıştırıcı ile kaplıysa dikiş atılması gereksizdir.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Farenin anestezi olmadan uyanmasına izin verin (bir ısıtma yastığı üzerinde yapılan kurtarma işlemi iyileşme süresini kısaltır) ve tamamen uyandığında ev kafesine geri koyun. Postoperatif analjezi olarak 72 saat boyunca yeterli olan bir deri altı doz buprenorfin SR (0.5 mg / kg) enjekte edin.
2. Ameliyattan sağlıklı bir şekilde iyileşmeyi kolaylaştırmak için, fareye yumuşatmak için suya batırılmış normal katı yemek veya jel şeklinde yiyecekler gibi ekstra yumuşak yiyecekler sağlayın.
   NOT: Ameliyattan hemen sonra bir kerelik yumuşak gıda verilmesi yeterlidir.
3. Ameliyat işleminin ilk 72 saati boyunca sağlık ve uygun iyileşme için fareyi günlük olarak izleyin. Daha sonra, pencereden görüntüleme implantasyon ameliyatı 2 hafta gibi kısa bir sürede gerçekleştirilecektir.
   NOT: İyi yapılırsa, fareler normal gezici davranışlar, yeterli kafes keşfi, iyi hidrasyon, stabil kilo alımı ve kafesteki diğer farelerle ve kafesteki diğer öğelerle kapsamlı etkileşimler göstererek iyi iyileşir. Ameliyattan sonra uyuşukluk, dehidrasyon ve% 10'dan fazla kilo kaybı gösteren fareler ötenazi yapılır ve çalışmadan çıkarılır.

4. İlk görüntüleme için iki fotonlu beyin haritalaması

1. Fareyi uyuşturun (Isoflurane, %5 indüksiyon ve %1,5 bakım). Kafa plakasını 35 ° C'de bir ısıtma plakası üzerinde tutulan iki fotonlu mikroskop aşamasına monte etmek için vidaları kullanarak kafayı sabitleyin. Rhodamine B (2 mg / mL) gibi intraperitoneal olarak 100 μL kan damarı boyası enjekte edin.
   NOT: Görüntüleme, anestezi olmadan uyanık farelerde de yapılabilir. Bununla birlikte, son çalışmalar anestezinin mikroglial sürveyans dinamiklerini etkilediğini göstermektedir. Uyanık farelerde iki fotonlu görüntüleme için kafa fiksasyonu, en az 25 gün boyunca kronik görüntüleme sırasında bile stresi artırır.
2. %70 etanol batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak kafatası penceresinin yüzeyini nazikçe temizleyin. Kraniyal pencereye birkaç damla su veya tuzlu su damlatın ve objektif lensi bir daldırma lensi olduğu için objektif lensi solüsyona indirin.
3. Epifloresan ile göz merceğinden bakarken bir laboratuvar defterindeki ana kan damarı yer işaretlerini belirtmek için kaba bir harita çizin. İki fotonnlu görüntüleme sırasında belirli bölgeleri tanımlamak için bu çizimi kullanın. Alternatif olarak, mikroskoba takılan bir kamera veya elde tutulan bir kamera veya telefon aracılığıyla kan damarlarının fotoğraflarını çekin.
   NOT: Bu elle çizilmiş görüntüler ve resimler, iki foton görüntülemeden önce mikroskop altında aynı geniş bölgeleri tekrar ziyaret etmeyi kolaylaştırmak içindir. Bunlar kesin görüntü eşleme değildir.
4. İki foton görüntüleme altında, gerektiğinde floresan hücrelerin ve damarların görüntülerini toplayın. Kesin bölgelerin sonraki görüntüleme için yeniden ziyaret edilebilmesini sağlamak için uygun koordinatlarla dikkatli notlar alın. Bu ilk görüntüleme oturumunda birkaç görüş alanı toplayın, örneğin bir doku hacmi boyunca her 1-2 μm'de bir z-yığını görüntüleri elde edin.
   NOT: İki fotonla görüntü toplarken, kan damarı yer işaretleri kaba haritalama için kullanılır. İnce haritalama gerekiyorsa, Thy1-YFP farelerinden YFP etiketli dendritler kullanılır.
   1. Görüntüleme için bu önerilen parametreleri kullanın: 880-900 nm dalga boyu en uygunudur; GFP ve/veya dsRed / Rhodamine uyarımı için 525/50 nm (yeşil kanal) ve 620/60 nm (kırmızı kanal) emisyon filtrelerine sahip 565 nm dikroik ayna kullanılır; GFP ve YFP ayrımı için 500/15 ve 537/26 nm emisyon filtreli 509 nm dikroik ayna kullanılır; beyindeki güç 25 mW veya altında tutulur; görüntü çözünürlüğü 1024 x 1024 piksel, 1,5X yakınlaştırma faktöründe 25X 0,9 NA objektifle çekilen görüş alanı 295,24 x 295,24 μm'dir.
5. Görüntülemenin sonunda, fareyi sahneden indirin, anesteziden uyanmasına izin verin ve gelecekteki bir görüntüleme seansına kadar ev kafesine dönün.

5. İki fotonlu görüntüleme ve yeniden görüntüleme

1. İlk görüntüleme seansından birkaç saat ila aylar sonra herhangi bir yerde olabilen sonraki görüntüleme seansları için, fareyi uyuşturun (Isoflurane, %5 indüksiyon ve %1,5 bakım), iki fotonlu mikroskoba monte edin, bir ısıtma plakasına tutun ve 100 μl'lik Rhodamine B gibi bir kan damarı boyasını yeniden enjekte edin (2 mg / mL).
2. Daha önce elde edilen görüntüleri ImageJ'de açın ve bu görüntüleri ve önceki oturumdaki notları kullanarak, daha önce görüntülenen alanları belirleyin ve dikkatlice yeniden görüntüleyin.
3. Görüntüleme penceresi net olduğu veya etüdün kapsamı için gerekli olduğu sürece bunu tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Siyanoakrilat yapıştırıcı (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products<
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Matkap Ucu	Fine Science Tools	#19008-07
Eye Omerment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer glue)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

td style='width:186pt;'>910860-1