Transgenik Bir Farenin Diyaframındaki Nöromüsküler Kavşaklarda Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Heredia, D. J., et. al. Fare diyaframının üçlü sinapsında hücreye özgü kalsiyum sinyalinin ex vivo görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video floresan görüntülemeyi göstermektedir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade eden transgenik bir farede nöromüsküler kavşaklarda (NMJ'ler) kalsiyum dinamikleri. Bir NJM, frenik sinir ile diyaframdaki floresan etiketli asetilkolin reseptörleri ile tanımlanır. Aynı anda birden fazla sinyali görselleştirmek için bir görüntü ayırıcı kullanılır. Bir elektriksel uyaran verilir ve kalsiyum akışına yanıt olarak NMJ'deki floresanstaki değişiklik kaydedilir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Transgenik Farelerden Diyaframların ve Frenik Sinirlerin Hazırlanması

1. Bu fareleri genotiplemek için transgenik fareler ve oligonükleotid primerleri satın alın.
   1. Uygun transgenik/knock-in Cre-driver alelinin bir kopyasını ve koşullu GCaMP3/6 alelinin sıfır kopyasını ifade eden 3 ila 6 aylık bir fareyi, koşullu GCaMP3/6 alelinin bir veya iki kopyasını ve Cre-driver alelinin sıfır kopyasını ifade eden aynı yaştaki ikinci bir fare ile yetiştirin.
   2. Yavruları genotipleyin ve hem Cre hem de koşullu GCaMP3 / 6 alellerine sahip olanları işaretleyin - bunlar bundan böyle çift transgenik fareler olarak adlandırılacaktır (örneğin, Myf5-Cre, koşullu GCaMP3).
      Note: Bu şekilde, tüm veriler hem Cre hem de koşullu GCaMP3/6 alellerinin bir kopyasını ifade eden farelerden türetilecektir. Bu, bu melezlere diğer mutant fareler (örneğin, nakavtlar) eklenirken özellikle önemlidir.
2. Çift transgenik fareler uygun yaşta olduğunda (ör., doğum sonrası gün 0 veya 5 [P0 veya P5] veya yetişkin), fareleri makasla (P10'dan genç fareler için) dekapite ederek ötenazi yapın veya onları bir izofluran inhalasyon odasına yerleştirerek. Kuyruğu bir çift forseps ile sıkıştırmaya artık tepki vermediklerinde, fedakarlık yapmaya hazırdırlar.
3. Hayvanı bir makasla başını keserek kurban edin.
4. İridektomi makası ile karaciğerin hemen altında ve kalbin ve akciğerlerin hemen üzerinde tüm hayvan boyunca enine kesit.
5. Karaciğeri, kalbi ve akciğerleri inceleyin, frenik sinirin bir emme elektroduna çekilmek için yeterince uzun bir uzunluğunu korumaya dikkat edin (yani, 1-2 cm).
   Note: Sol frenik sinir, sol diyaframın medial kısmına giren beyaz bir doku parçası olarak tanımlanabilir. Akciğerler çıkarılırken kesilmemelidir. Sağ frenik sinir, superior vena kava'yı da içeren ve vena kava'dan daha ince ve daha beyaz olan bir fasya parçası içinde ilerler. Birlikte, her ikisi de sağ medial diyaframa nüfuz eder.
6. Diyaframın etrafındaki ince çıkıntı dışında göğüs kafesini ve vertebral kolonunu daha fazla çıkarın.
7. Diyaframı ve frenik sinir örneğini karanlıkta 10 dakika boyunca 1 μg / mL 594-αBTX içeren Krebs-Ringer solüsyonlu bir mikrofüj tüpüne yerleştirin.
   Note: Bu 594-αBTX konsantrasyonu, asetilkolin reseptörlerini (AChR'ler) işlevlerini bloke etmeden (kişisel gözlem) etiketler.

2. Kas Aksiyon Potansiyellerinin Uyarılması ve Kaydedilmesi

1. Minutien pimleri kullanarak, diyaframı silikon dielektrik jel ile kaplanmış ve ~8 mL oksijenli Krebs-Ringer çözeltisi ile doldurulmuş 6 cm'lik bir tabağa sabitleyerek hareketsiz hale getirin ve mikroskop aşamasına yerleştirin. Diyaframı 30 dakika boyunca daha fazla Krebs-Ringer solüsyonu (8 mL / dak) ile perfüze edin.
   Note: Bu, bağlanmamış 594-αBTX'i durular ve diseksiyondan sonra dokuyu dengeler.
2. Belirlenen yöntemlere göre bir emme elektrodu yapın.
   1. 4X büyütmede, bir mikromanipülatör kullanarak, aspirasyon elektrodunu sol frenik sinirin üzerine getirin ve aspirasyon elektroduna bağlı boruya bağlı 5 mL'lik bir şırınganın namlusunu dışarı çekerek aspirasyon uygulayın.
      Note: Emme elektroduna başarılı bir şekilde çekildiğinde, frenik sinir gergindir. Stimülatörü açın ve manuel anahtarı 1x çevirerek frenik siniri uyarın.
   2. Diyaframı parlak alan aydınlatması ile görsel olarak inceleyerek 1 Hz stimülasyona yanıt olarak kasıldığından emin olun. Değilse, kas kasılmasının görsel olarak incelenmesiyle doğrulanabilen supramaksimal bir nabız elde etmek için voltaj düğmesini kademeli olarak çevirerek voltajı ayarlayın. Hala görünmüyorsa, şırınga ile siniri üfleyin ve emme uygulayarak tekrar çekmeye çalışın.
3. Perfüzyonu kapatın ve kasa özgü miyozin inhibitörü BHC6'yı veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti μ-konotoksini8 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
   1. 100 μM BHC yapmak için, DMSO'da 4 μL 200 mM stoğu pipetleyin ve 1 mL Krebs-Ringer solüsyonunda önceden seyreltin.
   2. Tabaktan 1 mL Krebs-Ringer solüsyonunu çıkarın.
   3. Önceden seyreltilmiş BHC'yi tabağa ekleyin.
      Note: Bu ön seyreltme, GCaMP3 eksprese eden hücrelerde geçici olmayan bir floresan yanıtının seyreltilmemiş DMSO ile indüksiyonunun önlenmesine yardımcı olur.
   4. 30 dakika bekleyin ve ardından taze Krebs-Ringer solüsyonunun perfüzyonunu 20-30 dakika daha açın.
4. Kayıt elektrodunu hazırlayın.
   1. Eldiven giyerek, dış çapı (OD) 1 mm ve iç çapı (ID) 0,4 mm olan borosilikat filamentli bir camı bir mikropipet çekiciye yerleştirin, kelepçeyi yerine oturtmak için kadranları sıkın ve çektirme kapağını kapatın.
   2. Bir P-97 çektirme kullanarak aşağıdaki ayarları programlayın: 900'de ısıtın, 120'de çekin, 75'te hız, 250'de zaman, 500'de basınç ve ek döngü yok.
      Note: Direnç (R), amplifikatörün yazılım kontrolleri kullanılarak ölçülür: veri toplama yazılımı, V = IR formülünü çözerek direnci doğrular. Yazılım denetleyicisi, elektrottan bilinen bir akımı (I) (tipik olarak 1 nA) geçirir ve voltajdaki (V) değişikliği ölçer, böylece R'yi çözmemizi sağlar.
   3. Embriyonik diyaframlar için direncin 60 MΩ ve daha eski diyaframlar için 10 - 20 MΩ olduğundan emin olun. Kayıt elektrodunu 3 M Posatium klorür (KCl) ile yükleyin.
5. 10X büyütmede, sahnenin karşı tarafında uyarıcı bir elektrot olarak ikinci bir mikromanipülatör kullanarak elektrodu kasın içine indirin.
6. Elektrofizyolojik veri toplama yazılımını kullanarak, dinlenme membranı potansiyeli 0 ila -65 mV veya altına değişene kadar bekleyin.
7. 1 Hz'de uyarın ve mütevazı bir aşma sergileyen büyük bir potansiyeli (-0 mV veya altında başladığında 65 mV'un üzerine çıkan potansiyel) kontrol ederek bir kas aksiyon potansiyelinin varlığını doğrulayın. Bir stimülasyon artefaktını bir aksiyon potansiyeli ile karıştırmayın.
   Note: Potansiyeller, stimülasyon artefaktlarından önemli ölçüde daha uzundur (~ 5 ms).

3. Numunenin floresansının görüntülenmesi

1. 20X büyütmede, yeşil/sarı ışık uyarımı (550 nm) altında 594-αBTX etiketli Nöromüsküler kavşaklar veya NMJ'ler arayarak kasın merkezindeki uç plaka bandını bulun. Mavi ışık uyarımına (470 nm) geçerek görüntüye Ca²⁺ yanıtları, motor nöron veya Schwann hücreleri.
2. İstenirse, görüntü ayırıcıyı bant geçiren filtreler ve çift dalga boylu görüntüleme için dikroik tek kenarlı filtre ile ayarlayın.
3. GCaMP3 / 6 eksprese eden doku tarafından sergilenen maksimum floresanı (Fmax) hesaplamak için, diyafram preparatlarına 12 μL 3 M potasyum klorür (KCl) ekleyin.
   1. Arama tablosu çubuğundaki parlaklık çubuğu, GCaMP3/6 eksprese eden dokunun KCl'ye yanıt olarak gruplama olmadan 20X büyütmede doygunluk sergilediği seviyenin %110'una ayarlanmış olarak deneyler gerçekleştirin.
4. Hızlı olayları kaçırmamak için saniyede 20 kare hızında kayıt yapın.
5. 1 - 45 sn 20 - 40 Hz sinir stimülasyonu ile aspirasyon elektrodu kullanarak bir dizi impuls vererek uyarın veya banyo uygulaması veya perfüzyon ile farmakolojik agonistler ekleyin ve dinamik floresan toplayın Ca²⁺ yanıtlar.
   Note: Dokuya özgü kırmızı veya uzak kırmızı genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI) veya genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri (GEVI) fareleri NMJ'de kullanım için uygun hale gelirse, NMJ'de iki farklı hücresel elementi yansıtan iki dinamik sinyali toplamak için kullanılabilirler.
6. İstenen sonuçlar elde edildiği için görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler bittiğinde, perfüzyon hatlarından su perfüze edin ve tuzların birikmemesini sağlamak için emme elektrodundan 2x - 3x su emdirin.

Malzemeler