Fare Beyin Dokusunun İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılması Görüntülemesi

Özet

Source: Espinoza, R., et al. Doku teşhisi için fare beyninin gerçek zamanlı, iki renkli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2022).

Video, fare beyin dokusu bölümlerinin iki renkli uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesini gösterir. İki senkronize lazer ışını, moleküler titreşimleri uyarmak için doku bölümüne yönlendirilir ve bu da ışınlarda nispi bir yoğunluk değişikliğine neden olur. Dokudaki lipitler ve proteinler, lazer ışınlarının farklı frekans çiftleri kullanılarak tespit edilir. Elde edilen sinyallere daha sonra ayrı renkler atanır ve dokudaki proteinleri ve lipitleri tanımlamaya yardımcı olan iki renkli bir görüntü oluşturur.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. SRS sinyal algılama

1. Elektrooptik modülasyon (EOM)
   NOT: Stokes genliğini modüle etmek için 20 MHz'lik EOM kullanılır. Daha sonra tartışıldığı gibi, EOM, ortogonal modülasyon için gerekli olan 80 MHz lazer darbe dizisinden türetilmiştir. Yalnızca tek renkli veya hiperspektral SRS gerçekleştirilirse diğer modülasyon frekansları kullanılabilir. Bu durumda, modülasyon frekansının lazer frekansına senkronizasyonu gereksizdir. EOM'yi sürmek için radyo frekansı (RF) güç amplifikatörüne sahip bir frekans jeneratörü kullanılabilir. Sonuç olarak, 1.1.1-1.1.4 adımları atlanabilir.
   1. Işının 'unu almak için Stokes ışın yoluna bir ışın örnekleyici yerleştirin ve 80 MHz darbe trenini algılamak için hızlı bir fotodiyota gönderin.
      NOT: Fotodiyot sinyali, 20 MHz TTL çıkışı oluşturmak için bir frekans bölücüye gönderilir. Bu çıkış, çıkışı dört özdeş 20 MHz çıkışa çoğaltmak için bir fanout arabelleğine gönderilir. Çıkışlardan biri osiloskopu tetiklemek için kullanılır.
   2. Fanout arabelleğinin çıkışlarından birini alın ve 20 MHz sinüzoidal dalga elde etmek için bir bant geçiren filtre ile filtreleyin. Çıkış tepeden tepeye voltajını ~500 mV'a ayarlamak için bir RF zayıflatıcı kullanın.
   3. Elde edilen çıktıyı, RF fazının bir voltaj kaynağı ile ince ayarlanmasına izin veren bir faz değiştiriciye gönderin. Bu çıkışı bir RF güç amplifikatörüne gönderin ve amplifikatörün çıkışını EOM'ye bağlayın.
   4. Stokes ışınının engelini kaldırın ve ışın yoluna bir fotodiyot yerleştirerek EOM1'in modülasyon derinliğini optimize edin. Modülasyon derinliği (vadi / tepe oranı) tatmin edici görünene kadar EOM voltajını ve çeyrek dalga plakasını ayarlayın.
      NOT: 20 MHz modülasyonda (lazer tekrarlama hızının 1/4'ü), her 50 ns'de bir iki darbe beklenir.
2. Zamansal örtüşme
   NOT: Pompa ve Stokes'un zamansal örtüşmesi, bir gecikme aşamasına monte edilmiş bir retroreflektör ile iki lazer darbe dizisinden birinin geciktirilmesiyle elde edilir (Şekil 1, Stokes'un geciktiğini gösterir). Kaba örtüşme osiloskop ile izlenir ve ince örtüşme SRS sinyali tarafından izlenir. Varsa bir otokorelatör ile ince zamansal örtüşme de elde edilebilir.
   1. Lazer ışınını algılamak için dikroik aynanın arkasına bir fotodiyot yerleştirin. Önce Stokes ışınını bloke edin. Osiloskop üzerindeki pompa darbe tepe noktalarından birini yakınlaştırın. Bu zirvenin zamansal konumunu osiloskopla işaretlemek için dikey bir imleç yerleştirin.
   2. Pompa kirişini bloke edin ve Stokes kirişinin blokajını kaldırın. Osiloskop üzerindeki tepe konumunu önceki adımda işaretlenen konumla zamansal olarak eşleştirmek için gecikme aşamasını çevirin. Bkz. Şekil 2 iki ışının zamansal örtüşmesinin bir gösterimi için.
      1. (İSTEĞE BAĞLI) Gecikme aşamasının ötelemesi iki ışını zamansal olarak eşleştirmek için yetersizse, gecikme aşamasını hareket aralığının ortasına getirin.
      2. İki ışın arasındaki zamansal farkı alarak ve iki ışını zamansal olarak eşleştirmek için gereken mesafe miktarını bulmak için farkı ışık hızıyla çarparak iki ışını eşleştirmek için gereken gecikme mesafesini hesaplayın.
      3. Daha hızlı ışının ışın yolunu uzatın veya daha yavaş ışının ışın yolunu, zamansal gecikmeyi buna göre kabaca eşleştirmek için kısaltın.
   3. Numuneyi slayt ile bir lamel arasında tutmak için dimetil sülfoksit (DMSO) ve ara parça olarak çift taraflı bant içeren bir mikroskop lam numunesi hazırlayın.
   4. Numuneyi, lamel tarafı mikroskop objektifine bakacak şekilde mikroskobun üzerine yerleştirin. Mikroskobu parlak alan aydınlatmasına değiştirin ve numuneyi göz merceğinden gözlemleyin. Önce cam bant arayüzündeki hava kabarcıklarının hem üst hem de alt katmanındaki odağı bularak numunenin odağını bulun ve ardından odağı iki bant katmanı arasında olacak şekilde hareket ettirin.
      NOT: Göz merceğine bakmadan önce lazer ışınlarının engellendiğinden emin olun.
   5. Ayarlanabilir ışın çıkışını 798 nm'ye ayarlayın. Kondansatörün optik verimine bağlı olarak, objektif odaktaki pompa ve Stokes ışınları için optik gücü her biri ~40 mW olacak şekilde ayarlayın.
   6. ScanImage {{}}MATLAB'da (veya mikroskobu kontrol eden başka bir tarama yazılımında) açın ve taramaya başlamak için FOCUS etiketli düğmeye tıklayın.
      NOT: Lazer ışınları, bir görüntü oluşturmak için örnek boyunca raster taramasından geçirilecektir. Fotodiyottan (<100 kHz) gelen düşük frekanslı sinyal çıkışı, doğrudan veri toplama kartının 1. kanalına (DC kanalı olarak adlandırılır) gönderilir. Fotodiyottan gelen yüksek frekanslı çıkış (>100 kHz) kilitli amplifikatöre gönderilir ve kilitli amplifikatör sinyalinin X çıkışı, veri toplama kartının 2. kanalına (AC kanalı olarak adlandırılır) gönderilir.
   7. DC sinyalini kanal 1 ekranında ortalamak için direksiyon aynasını galvo tarayıcıdan önce ayarlayın. Motorlu gecikme aşamasını hareket ettirin ve kanal 2 (yani AC kanalı) ekranında gösterilen kilitleme çıkışını yakından izleyin.
      NOT: Pompa ve Stokes zaman içinde çakıştığında, AC kanalında bir sinyal görünecektir. Küçük yoğunluk değişikliğini görüntülemek için AC kanalının renk skalasını ayarlamak yardımcı olur.
   8. Zaman gecikmesini hassas bir şekilde ayarlayarak AC sinyal yoğunluğunu en üst düzeye çıkarın. SRS sinyalini AC kanalında ortalamak için dikroik aynayı ayarlayın (DC kanalını merkezde tutarken). Kilitleme amplifikatörünün fazını ayarlayın sinyali en üst düzeye çıkarmak için. Tatmin edici bir sinyal için Şekil 3'ye bakın.

3. Spektral çözünürlük optimizasyonu

NOT: Numuneye ulaşan pompa ve Stokes kirişleri, spektral çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için aynı miktarda grup gecikme dağılımına (GDD) sahip olmalıdır. Dağılım büyük ölçüde deney düzeneğine bağlıdır. Burada açıklanan deney düzeneği, Stokes ve pompa olarak sırasıyla 1.040 nm ve 800 nm'de femtosaniye darbelerini kullanır. Darbe germe ortamı olarak yoğun çakmaktaşı cam çubuklar (H-ZF52A) kullanılır.

1. 48 cm'lik yüksek dağılımlı bir cam çubuk (H-ZF52A veya eşdeğer yoğun çakmaktaşı cam) 800 nm ışın yoluna yerleştirin. Eq (1)

   

   NOT: Farklı dalga boylarında çeşitli cam malzemelerin GVD'si kırılma indisi veritabanı kaynağından bulunabilir. Örneğin, H-ZF52A, 800 nm'de 220.40 fs²/mm GVD'ye sahiptir. Toplam GDD 105792 fs².

2. Pompanın GDD'sine uyacak şekilde 1.040 nm ışın yoluna eklemek için kaç cm dağıtıcı cam çubuk gerektiğini hesaplayın. 1,040 nm ışının GDD'si ile kabaca eşleşecek şekilde 800 nm ışın yoluna uygun uzunlukta dağıtıcı cam çubuklar yerleştirin. Cam çubukların eklenmesinin iki kirişin zamansal örtüşmesini değiştireceğini ve gecikmenin ayarlanmasının gerekli olabileceğini unutmayın.
3. Spektral çözünürlüğün kalibrasyonu
   1. DMSO ile mikroskop slayt örneği yapın. Slaytı mikroskobun üzerine yerleştirin ve mikroskop kondansatöründen çıkan ışınların gücünü kontrol edin. Gücü, numune odağında her biri ~ 40 mW olacak şekilde ayarlayın.
   2. MATLAB'dan ScanImage 'yi açın. DMSO'nun 2.913 cm^-1 Raman zirvesine karşılık gelen gecikme aşamasını tarayarak maksimum SRS sinyalini bulun. Çubukların yerleştirilmesi nedeniyle artan optik yol uzunluğu ile önceki aşama konumuna dayalı olarak aşama konumunu tahmin edin. Cam çubuklar eklendiğinde ışının küçük sapması nedeniyle ışın uzamsal örtüşmesini yeniden hizalayın.
   3. Motorlu sahneyi hareket ettirirken sırayla bir dizi SRS görüntüsü alarak hiperspektral bir SRS taramasından tasarruf edin.
      NOT: Gecikmeli tarama aralığı, DMSO'nun sırasıyla 2.913 cm^-1 ve 2.994 cm^-1 Raman zirvelerine karşılık gelen iki Raman zirvesini kapsar. Bu iki geçiş, 800 nm'lik bir pompa ve 1,040 nm'lik bir Stokes lazer kullanıldığında gözlenir.
   4. ImageJ veya MATLAB kullanarak DMSO çözümünün SRS spektrumlarını çizin. Büyük DMSO 2,913 cm^-1 tepe noktasını MATLAB'daki bir Gauss veya Lorentz fonksiyonuna sığdırarak zirvenin Yarı Maksimumunda (FWHM) Tam Genişliği hesaplayın.
      NOT: Temsili sonuçlar Şekil 4. Yalnızca bir geniş tepe noktası varsa, bu, spektral çözünürlüğün iki tepe noktasını ayırt etmek için çok zayıf olduğu ve daha fazla cam çubuk gerektiği veya taranan aralığın ikinci tepe noktasını tespit etmek için çok küçük olduğu anlamına gelir. Tipik olarak, kabul edilebilir bir spektral çözünürlük DMSO, >60 cm'lik bir cam çubuk uzunluğu kullanıldığında ~20-25 cm^{-1{{TAG_371 TAG_370}}'dir. Daha kısa darbelerle daha yüksek sinyaller için ticaret yapmak üzere doku görüntüleme için genellikle daha düşük bir çözünürlük kullanılır.}
4. (İSTEĞE BAĞLI) Pompa ile Stokes arasındaki GDD'yi eşleştirmek için gereken GDD miktarını ve çubukların uzunluğunu tam olarak hesaplamak için her bir kolun darbe süresini belirlemek için bir otokorelatör veya bir FROG (Frekans Çözümlü Optik Geçit) kullanın.
5. En uygun spektral çözünürlüğü bulmak için Stokes ışınındaki farklı çubuk uzunlukları için 3.3.2-3.3.4 adımlarını tekrarlayın, bu da en iyi GDD eşleşmesinin deneysel olarak bulunduğu anlamına gelir. Optimum spektral çözünürlük elde etmek için uzunlukları farklı olan birden fazla cam çubuk seti kullanın.

4. Sinyal-gürültü (SNR) karakterizasyonu

1. {{}} Adım 4.2'nin tam uzamsal ve zamansal hizalamadan sonra gerçekleştirildiğinden emin olun.
2. DMSO'nun 2.913 cm^-1 Raman zirvesine karşılık gelen bir SRS görüntüsü elde edin. Görüntüyü ImageJ'de açın ve çerçevenin ortasında küçük bir alan seçin. Seçilen alandaki değerlerin ortalama ve standart sapmasını hesaplamak için measure işlevini kullanın.

3. SNR değerini bulmak için seçilen alanın ortalama değerini standart sapmaya bölün, Eq (2).

   

   NOT: Her iki kol için odakta 40 mw/40 mw'de DMSO kullanan sistem için iyi bir SNR (4 μs'lik bir kilitlenme süresi sabiti ile) >800'dür. Veri toplama kartının sınırlı bir bit derinliğine sahip olması durumunda, SNR'nin daha doğru bir tahmini için daha düşük DMSO konsantrasyonları veya daha düşük güç kullanılabilir.

4. SNR çok düşükse, uzamsal örtüşmeyi, zamansal örtüşmeyi, ışın boyutu/kolimasyon eşleştirmesini ve/veya dağılım eşleştirmesini optimize etmek için lazer darbelerini yeniden hizalayın. Sapma düzeltme bileziği olan bir hedef için, düzeltme bileziğini ayarlayarak sinyali optimize edin.

5. Frekans ekseni kalibrasyonu

NOT: Bu adım, gecikme aşaması konumunu taranan Raman geçişiyle ilişkilendirmek için gerçekleştirilir. Uygun bir "Raman Cetveli" oluşturmak için çözücülerin dikkatli bir şekilde seçilmesi gerekir. DMSO, 2.913 cm^-1 ve 2.994 cm^-1 olmak üzere iki keskin Raman tepe noktasına sahip olduğu için CH bağları için etkili bir çözücüdür.

1. DMSO'nun 2.913 cm^-1-1{{}} Raman zirvelerini kapsayan gecikme aşaması aralığıyla bir hiperspektral tarama kaydedin. Hiperspektral veri kümesine karşılık gelen sahne alanı konumlarını kaydedin.
   NOT: Spektrumun küresel maksimum zirvesi DMSO 2,913 cm^-1 Raman kaymasına karşılık gelir ve ikinci maksimum tepe DMSO 2,994 cm^-1 Raman kaymasına karşılık gelir.
2. 2.913 cm^-1{{}}{{TAG_537 TAG_538}}^-1. Aşama konumunu Raman kaymasıyla ilişkilendiren doğrusal regresyon denklemini kullanarak, gecikme konumlarını karşılık gelen Raman frekanslarına dönüştürün.

6. Ortogonal modülasyon ve iki renkli görüntüleme

NOT: Ortogonal modülasyon adımı yalnızca gerçek zamanlı iki renkli görüntüleme gerektiğinde gereklidir. Bu şemanın şeması Şekil 5'da gösterilmiştir. Ortogonal modülasyon, ikisi arasında 90°'lik bir faz kayması ile lazer frekansının dörtte birinde (80 MHz lazer için 20 MHz) sürülen bir çift EOM kullanır. Bu ortogonal modülasyon adımı, tek renkli SRS görüntüleme veya hiperspektral SRS görüntüleme için atlanabilir.

1. EOM1 modülasyonu
   1. {{}} İlk EOM'den sonra Stokes ışın yoluna bir polarize ışın ayırıcı (PBS2), bir çeyrek dalga plakası (QWP2) ve ikinci bir EOM (EOM2) takın. Sinyal girişini EOM2'ye çıkarın. Sinyal girişini EOM1'e takın ve açın.
   2. Işını ilk EOM'den göndererek Stokes ışınını (1,040 nm'de sabitlenmiş) 20 MHz'de (f₀/4) modüle edin. Işının EOM kristali boyunca düz ve ortalanmış olarak çarptığından emin olmak için EOM1'in eğimini ve konumunu ayarlayın.
   3. İki fotodiyot ile PBS1'den çıkan her iki polarizasyonu gözlemleyerek ve modülasyonu bir osiloskopta görüntüleyerek modülasyon derinliğini izleyin.
   4. İletilen ışının modülasyon derinliğini 0'e yakın olacak şekilde optimize etmek için QWP1, EOM1 voltajını ve 20 MHz girişin fazını (bir faz değiştirici kullanarak) ayarlayın. Şekil 2B bölümüne bakın.
2. EOM2 modülasyonu
   1. EOM1'in fişini çekin ve EOM2'yi takın.
   2. İkinci amplifikatörün 20 MHz'deki yüksek voltaj çıkışını EOM2'ye gönderin. Işının EOM kristali boyunca düz ve ortalanmış olarak çarptığından emin olmak için EOM2'nin eğimini ve konumunu ayarlayın.
   3. Bir kez daha, bir osiloskop ile PBS2'den çıkan her iki polarizasyona bakarak modülasyon derinliğini izleyin. Her iki polarizasyon için 0'e yakın modülasyon elde etmek için QWP2, EOM2 voltajını ve faz değiştiriciyi gerektiği gibi ayarlayın.
   4. Darbe dizisi modülasyonunun ilk modülasyondan 90°'lik bir faz kaymasına sahip olduğundan emin olun.
      NOT: İki pompa darbe dizisi 90° ortogonal değilse, iki kanal arasındaki karışma bir sorun olacaktır.
   5. Hem EOM1 hem de EOM2'yi açıp takarak modülasyonun ortogonalliğini test edin. PBS2 tarafından bölünen her iki polarizasyonu bir osiloskop ile izleyin. İkinci PBS'den sonraki darbe dizisi Şekil 2C'ye benzemiyorsa, EOM1 ve EOM2'yi ayrı ayrı yeniden optimize edin.
   6. EOM20'nin akış aşağısına 2 mm'lik çift kırılmalı bir kuvars kristali (BRC) ve yarım dalga plakası (HWP) takın. Her iki EOM'yi aynı anda takın ve darbe dizisini Şekil 2D.
      NOT: Bu deneyde kullanılan cıvıltı için 20 mm BRC, 80 cm^-1 Raman kaymasına karşılık gelen bir zaman gecikmesine neden olur. Farklı bir cıvıltı kullanılıyorsa farklı bir BRC uzunluğuna ihtiyaç duyulabilir.
3. Kalibrasyon
   1. Kilitli amplifikatör X ve Y kanal çıkışından (veri toplama kartının 2. ve 3. kanallarına gönderilir) gelen sinyalleri algılayarak sistemi DMSO kullanarak kalibre edin.
   2. 2.913 cm^-1 tarafından üretilen sinyallerin daha hızlı polarizasyondan zirve yapıp yapmadığını ve daha yavaş polarizasyondan gelen sinyallerin kilitli amplifikatörde 90° faz dışı faza yakın olup olmadığını kontrol edin. Durum böyle değilse, iki sinyal faz dışı 90°'ye yakın olana kadar EOM hizalamasını ayarlayın.
   3. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, ortogonal kirişlerden biri için 2.930 cm^-1 cm'de protein geçişini inceleyen gecikme konumunu bulun. Diğer polarizasyonun 2.850 cm^-1 lipid geçişini probladığından emin olun.

7. Epi-mod SRS görüntüleme

NOT: İletim modu görüntüleme şemasında, objektif lazeri numuneye odaklar ve ardından bir kondansatör mercek, iletilen ışını kilitlenme tespiti için bir fotodiyota yönlendirir. Epi-mod görüntüleme şemasında, numune tarafından geri saçılan ve depolarize edilen ışık, odaklama objektifi tarafından yeniden toplanır ve bir polarize ışın ayırıcı kullanılarak izole edilir. İzole edilmiş ve geri saçılan fotonlar, kilitlenme tespiti için bir çift röle merceği aracılığıyla bir fotodiyota gönderilir. Şekil 6 epi-mod görüntüleme şemasını göstermektedir.

1. Mikroskoba giren ışının polarizasyonunu değiştirmek için ışın mikroskoba girmeden önce bir HWP takın. Depolarize geri yansıyan ışının dedektöre ulaşmasını sağlamak için hedefin üzerine bir PBS yerleştirin.
2. Geri saçılan fotonları objektifin arka açıklığından fotodetektöre iletmek için 75 mm akromat lens ve 30 mm asferik lensten oluşan bir çift lens kullanın. PBS tarafından yönlendirilen geri saçılan ışığı toplamak için dedektörü monte edin. Modüle edilmiş ışının dedektöre girmesini engellemek için bir filtre takın.
3. Doku örneğini objektifin altına yerleştirin. Kondansatör epi modlu görüntüleme için gereksiz olduğundan, daha fazla alan gerekiyorsa çıkarın.
4. Görüntüleme
   1. Bir deklanşörle kirişi engelleyin; numunenin üzerine yandan beyaz bir ışık kaynağı parlatın; ve objektif odaklamayı bulmak için BrightField'ı kullanın.
   2. Her iki ışının da engelini kaldırın ve kilitli amplifikatörün iki çıkışından dokudan lipid ve protein SRS görüntüleri elde etmek için önceden kalibre edilmiş gecikme konumlarını kullanın.
   3. İyi kalitede görüntüler elde etmek için kilitlenme kazancını ve piksel kutusu faktörünü ayarlayın.

8. Yanlış renk boyama

1. {{}} Görüntü yığınını ImageJ ile açın.
2. Lipid (2.850 cm^-1) ve protein (2.930 cm^-1) türüne karşılık gelen iki görüntüyü çıkarın Duplicate.
3. Lipid görüntüsünü lipids ve protein görüntüsünü proteinler olarak yeniden adlandırın.
4. Süreç | Görüntü Hesaplayıcı ve proteinleri çıkar lipids.
5. Image | Renk | Kanalları Birleştir, lipids yeşil ve proteinlerblue. görüntü kanallarını aracını açın (Image | Renk | Kanallar Aracı) ve parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (Image | Ayarla | Parlaklık/Kontrast).
6. kanalları aracını kullanarak her kanal için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Lipid kanalı için, hücresel özellikler koyu görünene kadar kontrastı ayarlayın. Protein kanalı için, hücresel özellikler mavi görünene kadar kontrastı ayarlayın. Image | Türü | RGB Rengi. Bu resmi Dosya | Farklı Kaydet | Tiff.
   NOT: Yanlış H&E boyama için, renk şeması pembe sitoplazma gösterirken, çekirdekler koyu mavi-mor renktedir.
7. Malzeme Tablosu içindeki yanlış H&E boyama komut dosyası kaynağından HE.m MATLAB komut dosyasını indirin.
8. HE.m komut dosyasını MATLAB'da çalıştırın. Yapay olarak H&E ile boyanmış bir görüntü oluşturmak için önceki adımdan dışa aktarılan RGB görüntüsünü seçin.
9. (İSTEĞE BAĞLI) Geniş görüş alanlı görüntüleme için görüntü yoğunluğunu normalleştirin, çünkü görüntü çevrede merkeze göre daha koyu görünür.
   1. Görüntülerin alan normalleştirmesini gerçekleştirmek için, mümkün olduğunca çok görüntünün ortalamasını alın. Ardından, ImageJ (Process | Filtreler | Gauss Bulanıklığı | yarıçap=50).
   2. Bulanık görüntünün maksimum yoğunluğunu ölçün (Ctrl+M). Bulanık görüntüyü maksimum yoğunluğa bölün (İşlem | Matematik | Böl). Ham SRS görüntüsünü bulanık görüntüye bölün ( İşlem | Görüntü | Hesap Makinesi).

Sonuçlar

Malzemeler

100 mm Akromatik Lens	THORLABS	AC254-100-B	Geniş bant, 650 - 1.050 nm, akromatik lens odak uzaklığı, 100 mm
20 MHz bant geçiren filtre	Minicircuits	BBP-21.4+	Topaklanmış LC Bant Geçiren Filtre, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Akromatik Lens	THORLABS	AC254-200-B	Geniş bant, 650 - 1.050 nm, akromatik lens odak uzaklığı, 200 mm
Akromatik Yarım Dalga Plakası	Union Optic<	Geniş bant yarım dalga plakası
Akromatik Çeyrek Dalga Plakası	Union Optic<	Geniş bant çeyrek dalga plakası
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Merkez dalga boyu yaklaşık 1.000 nm olan diğer dikroikler kullanılabilir.
DMSO (Dimetil sülfoksit)	Sigma Aldrich	472301	Raman kaymasının kalibrasyonu için çözücü. Bilinen Raman tepe noktalarına sahip diğer çözücüler kullanılabilir.
Elektrooptik Genlik Modülatörü	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Ortogonal modülasyon ve çift kanallı görüntüleme için iki EOM gereklidir. Daha düşük sürüş voltajının kullanılabilmesi için rezonanslı versiyon önerilir.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Arabelleği ve Hat Sürücüsü, EOM sürüş frekansını ve kilitlenme referansını oluşturmak için
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Dedektörü, 1 ns Yükselme Süresi
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for lazer çıkışından 20MHz üreten.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic<	Yüksek dağılımlı H-ZF52A Çubuk lens 120 mm, SF11 Çubuk lens 100 mm
Insight DS+	Newport		80 MHz tekrarlama hızıyla iki senkronize darbeli lazer (1.040 nm'de bir sabit ışın ve 680-1.300 nm arasında değişen bir ayarlanabilir ışın) çıkarabilen lazer sistemi.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Fotodiyottan SRS sinyalini çıkarmak için kilitli amplifikatör. Bir Zürih Enstrümanı HF2LI veya benzeri bir enstrüman da kullanılabilir.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Geniş Bant Dielektrik Ayna, 750 - 1.100 nm. Gümüş aynalar da kullanılabilir.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Pompanın ve Stokes lazerlerin zamansal örtüşmesinin hassas kontrolü için gecikme aşaması. Başka herhangi bir motorlu sahne çalışmalıdır.
Yağa Daldırma Kondensörü	Nikon	CSC1003	1.4 NA. NA>1.2 içeren diğer kondansatörler kullanılabilir.
Osiloskop	Tektronix	TDS7054	400 MHz bant genişliği veya daha yüksek olan başka herhangi bir osiloskop çalışmalıdır.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	Modülasyon frekansının fazını kaydırmak için
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Geniş alanlı (10 x 10 cm2) silikon PIN diyotu. Geniş alanlı ve düşük kapasitanslı diğer diyotlar kullanılabilir.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic<	Geniş bant polarize ışın ayırıcı
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Dik Açı Prizması. Diğer prizmalar veya retroreflektör kullanılabilir.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	Gümüş kaplamalı 5mm ayna seti kullandık
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Lazer taramalı mikroskop kontrol yazılımı
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25,0 mm Premium Kısa Geçiren Filtre, Kesme Dalga Boyu: 1.000 nm. Stokes'un verimli bir şekilde bastırılması için iki filtre gerekli olabilir.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Başka herhangi bir mikroskop çerçevesi kullanılabilir. Lazer tarama mikroskobu mevcutsa, doğrudan kullanılabilir. Aksi takdirde, mikroskoba bir galvo tarayıcı ve tarama merceği eklenmesi gerekiyordu.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	Multiphoton 25X Objektifin NA değeri 1.05'tir. Diğer benzer hedefler kullanılabilir.

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>WPA2210-650-1100-M25.4td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>WPA4210-650-1100-M25.4td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>CYLROD01td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>PBS9025-620-1000