Temizlenmiş Bir Fare Hipokampal Dokusunda Astrositlerin ve Uyarıcı Nöronların İki Foton Mikroskobu

Özet

Kaynak: Refaeli, R., et al., Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Uzamsal Etkileşimin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Video, hazırlanışını göstermektedir. floresan etiketli astrositler ve uyarıcı nöronlar arasındaki uzamsal etkileşimleri görselleştirmek için iki foton mikroskobu kullanılarak temizlenmiş fare hipokampal dokusunun bir odası ve nörogörüntülemesi.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Oda hazırlığı

NOT: Her numune, numunenin yerleştirileceği bir görüntüleme odasına sahip bir slayt gerektirir.

1. Örneği slaydın ortasına yerleştirin.
2. Sıcak bir tutkal tabancası kullanarak, sürgünün kenarlarında neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk (yaklaşık 5 mm) bıraktığınızdan emin olun (Şekil 1A, B).
3. Üst yüzeyi nemli tutmak ve lamel ile doku arasında kabarcıkların oluşmasını önlemek için numuneye 1-2 damla kırılma indisi eşleştirme solüsyonu veya RIMS uygulayın.
4. RIMS (Kırılma indisi eşleştirme solüsyonu) damlalarını uyguladıktan hemen sonra, duvarlara son sıcak tutkal katmanını ekleyin (beynin/dilimin yüksekliğine ulaşacak şekilde) ve hemen (sıcak tutkal hala sıvı haldeyken) adım 1.5'e ilerleyin.
5. Üst kısmı bir lamel ile kapatın ve hala sıcak tutkal tabakasının üstüne mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin (Şekil 1C).
6. Sıcak tutkal duvarlarında kalan boşluktan hazneyi RIMS ile doldurun (Şekil 1D, E).
7. Boşluğu sıcak tutkal ile kapatın. İçeride hava bırakmayın (Şekil 1F).
8. Sıcak tutkal duvarlar sürgünün sınırlarının dışına uzanıyorsa, uzayan kenarları kesin (Şekil 1G).
9. Görüntüleme için kullanılan objektif suya daldırılmışsa, daldırma solüsyonunun daha uzun süre dayanması için lamel üzerindeki duvarlara 2-3 mm daha yapıştırıcı ekleyin (Şekil 1H).

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Astrositleri tespit etmek için kullanılan viral vektör
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Nöronları tespit etmek için kullanılan viral vektör
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Nöronal çekirdekleri tespit etmek için kullanılan viral vektör
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Nöronları tespit etmek için kullanılan viral vektör
Imaris software	Bitplane, UK		Görüntülerin 3D analizine izin veren bir yazılım
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SyGlass software			Sanal gerçeklik kullanarak görüntülerin 3D analizine izin veren bir yazılım
Two photon microscope	Neurolabware		Ti:sapphire lazer (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP foto-çarpan tüpleri (Hamamatsu, H10770-40), bant geçiren filtre (Semrock), suya daldırma 16x objektif (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365