$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Serebellar granül nöronlarının veya CGN'lerin morfolojik analizleri - üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon ve yüzey alanı ve hücresel hacim
- {{}} Tek elektrogözenekli CGN'leri 63x objektifte 2x objektifte bir konfokal mikroskopta görüntüleyin, yığın başına 0,5 μm'de z-yığını görüntüleri alın. Kolay görüntü analizi ve yeniden yapılandırmaya izin vermek için görüntü penceresi başına bir hücre görüntüleyin.
- Üç boyutlu (3D) uzayda elektroporasyonlu CGN'lerin yapısını kolay ve verimli bir şekilde izlemek için aşağıdaki bağlantıyı (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) kullanarak FIJI için Simple Neurite Tracer eklentisini kurun.
NOT: Eklentinin (https://imagej.net/SNT) güncellenmiş bir sürümü vardır.
- Basit bir Nörit İzleyici kullanarak nörit uzunluğunu ve dendritik pençe oluşumunu kör bir şekilde analiz edin. Elektroporasyonlu CGN'lerin tek kanallı z-yığın görüntülerini FIJI'ye yükleyin ve Eklentiler | Segmentasyon | Basit Nörit İzleyici (Şekil 1D).
- Açılır menüye erişin ve Yeni 3D Görüntüleyici Oluştur'u seçin (Şekil 1D).
- Bir dendritin hücre somasına bağlandığı tabanına kaydırın ve bağlantı noktasına tıklayarak bir yol başlatın. Hücre doldurma sinyalinin en parlak olduğu bölümlere tıklayarak ve izi korumak için [y] tuşuna basarak yolu manuel olarak izleyin. Pençe içermiyorsa dendritin sonuna kadar veya pençenin tabanına kadar izleyin ve [f] tuşuna basarak yolu onaylayın (Şekil 2D).
- Ardından, yapının tabanında bir yol başlatarak ve en uzun nöritin sonuna kadar izleyerek pençeyi izleyin. Windows'ta [ctrl] veya Mac OS'ta [alt] tuşunu basılı tutup yolu tıklatarak ikincil ve üçüncül dalları izleyin. [f] tuşuna basarak yolu onaylayın.
- İzler için ölçümlerin ayrı bir pencerede göründüğünü gözlemleyin; Her pençe için toplam uzunluğu elde etmek için pençe dallarının (birincil, ikincil, üçüncül) tüm ölçümlerini toplayın.
- Elektroporasyonlu CGN'lerin yüzey alanını ve hücresel hacmini analiz etmek için Imaris hücre analiz yazılımını (https://imaris.oxinst.com/) indirin.
NOT: FIJI, hazır ve ücretsiz eklentileri kullanarak z-stack görüntülerinden hücreleri 3B olarak yeniden oluşturmak için de kullanılabilir. Ek olarak, Simple Neurite Tracer hacimsel bir işleme özelliğine sahiptir, ancak Imaris aşağıda belirtilen nedenlerle kullanılmıştır.
- Imaris'e elektroporasyonlu bir CGN'nin z-stack görüntüsünü yükleyin. Aş tuşuna basarak 3B yeniden yapılandırma araç setine erişin.
- CGN'yi yeniden oluşturmak için Yüzeyler'e basın ve görüntü penceresinde hücrenin tamamını kapsayan bir ilgi alanı seçin. Bitirdikten sonra, Oluştur'un altında sağ alt köşedeki mavi ileri oka basın.
- Görüntüde farklı sinyaller için birden fazla kanal varsa, elektroporasyonlu CGN'yi içeren kanalı seçin ve mavi ileri oka basın.
- Kenar çubuğunu kullanarak, elektroporasyonlu hücrenin sinyaline en doğru şekilde uyan istenen bir eşiği ayarlayın. Eşiği doğru bir şekilde belirlemek için hücrenin yüzeyine daha yakın yakınlaştırın. Bitirdikten sonra, hücreyi yeniden oluşturmak ve meta verilerden yüzey alanını ve hacim boyutunu elde etmek için çift yeşil oka basın.
