$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
Mikroglia ve nöronal kalsiyum dinamiklerinin in vivo iki fotonlu görüntülemesi
1. Farelerin mikroskop cihazına alışması
- Ameliyattan üç hafta sonra, farede %3 izofluran ile anestezi indükleyin ve fareyi özel yapım bir stereotaksik alet kullanarak iki fotonlu bir mikroskobun 25x objektif merceğinin altına yerleştirin (Şekil 1C). Kurulum için, fare bir koşu bandının üstüne yerleştirilir ve serbestçe çalışmasına izin verilir.
- Yaklaşık 10 dakika sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın ve ev kafesine geri koyun. İki fotonlu görüntü elde etmeden önce alışkanlığı her alternatif günde en az 3 kez tekrarlayın.
2. İki fotonlu görüntü elde etme
NOT: Mikroglial aktivasyon kademeli olarak bazal seviyeye döndüğü için görüntü alımını ameliyattan 4 haftadan daha uzun bir süre sonra gerçekleştirmenizi öneririz.
- Farede% 3 izofluran ile anesteziyi indükleyin ve fareyi özel yapım bir stereotaksik alet kullanarak iki fotonlu mikroskobun objektif merceğinin altına yerleştirin.
- Özel yapım gölgeleme cihazını (Şekil 1A ve Şekil 1B) ve aşağıda açıklandığı gibi görsel stimülasyon için bir LCD monitör kurun (Şekil 1D).
- Lensi beyin yüzeyine odaklanacak şekilde konumlandırın ve ardından bu lens konumunu orijinal Z konumu olarak ayarlayın. XY koordinatlarını sabit tutun ve objektif lensi yükseltin; Fareyi ve stereotaksik aleti objektif merceğinden ve koşu bandından çıkarın.
- Kömür tozu ile karıştırılarak karartılan silikon kullanarak kafa plakasının üstüne bir gölgeleme cihazı takın ve kafa plakası ile gölgeleme cihazı arasındaki boşluğun iyi kapatıldığından emin olun.
- Gölgeleme cihazını damıtılmış suyla doldurun ve ardından fareyi ve stereotaksik çerçeveyi tekrar objektifin altına ve koşu bandına sabitleyin. Objektif merceğin derinliğini kontrol ederek beyin yüzeyindeki odak düzlemini dikkatlice sıfırlayın.
NOT: Objektif merceğine zarar verme riskini önlemek için önce xyz koordinatlarını ayarlayın ve ardından objektif merceğin gölgeleme cihazını uygulayın. Önce kapağı takmak ve ardından koordinatları ayarlamak da mantıklıdır, ancak bu seçenek için dikkatli kullanım gereklidir. - Objektif merceğinden görsel stimülasyon için kullanılan LCD monitörden ışık kirlenmesini önlemek için objektif merceğini siyah alüminyum folyo ile kapatın (Şekil 1D). Görsel uyaranları sunmak için farenin gözlerinin önüne 12,5 cm uzaklıkta 10 inçlik bir LCD monitör ayarlayın (Şekil 1D).
- Floresan emisyon toplama filtrelerini EGFP floresan (525/50 nm emisyon filtresi) ve R-CaMP floresan (593/46 nm emisyon filtresi) ve uyarma dalga boyunu 1.000 nm olarak yapılandırın. 25x 1,1 NA objektif ve GaAsP PMT'leri kullanarak 0,25 μm/piksel uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler elde edin.
- R-CaMP (+) nöronlarının ve EGFP (+) mikroglia'nın 2/3. katmanda aynı anda görüntülenebildiği görüntüleme bölgesini bulun. Bu kurulum için, Şekil 2'de elde edilen veriler, canlı bir görüntü önizlemesi kullanılarak piyal yüzeyden 100 μm derinlikteydi. Foto-ağartmayı ve görüntüleme bölgesinde artan lokal sıcaklığın neden olduğu hasarı önlemek için uyarma lazerinin gücünü mümkün olduğunca düşük tutun.
- Görüntü elde etme ile eş zamanlı olarak, fareye 30°'lik adımlarla 0° ila 150° arasında 6 yönde 12 yönde %100 kontrast, 1,5 Hz, derece başına 0,04 döngüde sürüklenen ızgaralı bir görsel uyaran sunun.
- Görüntü alımından sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın, gölgeleme cihazını ve stereotaksik aleti fareden ayırın ve fareyi ana kafesine geri koyun.
