Sıçan Beyin Dokusunda Yeni Üretilen Nöronların Optik Fraksiyonatör Tekniği Kullanılarak Ölçülmesi

Abstract

Kaynak: Olesen, M. V., et al. Elektrokonvülsif Tedavinin Bir Sıçan Modelinde Hücre Sayılarını Tahmin Etmek için Optik Fraksiyonlayıcı Tekniği. J. Vis. Uzm. (2017).

Video, beyin dokusunda yeni üretilen nöronları ölçme tekniğini göstermektedir. Bromodeoksiüridin (BrdU) işaretli nöronları içeren hipokampal doku dilimleri, immünohistokimya kullanılarak boyandı ve daha sonra optik fraksiyonatör tekniği kullanılarak doku kalınlığı boyunca ölçüldü.

Protocol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Doku işleme

NOT: 4 °C'de 0,2 M fosfat tamponunda seyreltilmiş %4 paraformaldehit (PFA) içinde transkardiyal perfüzyon ve postfiksasyonun ardından, beyinler 4 °C'de üç gün boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %30 sükroza aktarılır. Bundan sonra, beyinler toz haline getirilmiş kuru buz üzerinde dondurulur ve bölümlere ayrılana kadar -80 ° C'de saklanır.

1. Bir neşter kullanarak beynin orta hattı boyunca sağ ve sol yarım küreleri ayırın. Ardından, ilk beyinde rastgele bir veya diğer yarım küreyi seçin. Daha sonra, sağ ve sol yarım küreler arasında sistematik olarak geçiş yapın (Figure 1A). Örneklenen yarım küreyi, bir montaj ortamı kullanarak uzun ekseni diske dik olacak şekilde bir numune diskine monte edin.
2. Kriyostatta ön soğutma için numaralı çok çanaklı kaplar yerleştirin.
3. Örnek diski kriyostata monte edin ve hipokampusun tamamını (Bregma 1.80 ila - 7.04) koronal düzlemde 80 μm kalınlığında bölümlere kesin (Figure 1B).
   1. Kesitleri kesme sırasında tutmak için örneklenen tüm bölümleri soğutulmuş çok tabaklı kaplara art arda yerleştirin.
   2. Bölümleri tamamen kriyoprotektan ile örtün ve daha fazla kullanana kadar kapları -20 °C'de tutun.

2. İmmün boyama

NOT: Boyama prosedürü boyunca tek tek bölümleri takip etmek için, örneklenen bölümleri 25 oyuklu boyama ağlarına yerleştirin. İmmün boyama ve sonraki hücre sayımı için hipokampus başına ortalama 12 (8-16) bölüm vererek her 5. bölümü kullanın.

1. ve n bölümleri arasında rastgele bir başlangıç yaparak her n'inci bölümü alt örneklemeden önce (Figure 1C), kapları -20 °C'den oda sıcaklığına (RT) aktarın.
2. Örneğin, bölümleri sayısal sırayla fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş Petri kaplarına yerleştirilen 25 oyuklu boyama ağlarına aktarmak için bir boya fırçası kullanın.
   NOT: <span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' >Bu noktadan sonra, boyama ağlarındaki bölümleri, bir orbital çalkalayıcı üzerinde eşleşen cam tabaklara yerleştirilmiş halde tutun (bölüm 2.3 ila 2.9).
3. Boyama ağlarını eşleşen cam tabaklara aktarın ve %3 hidrojen peroksit (H₂O₂) distilled water (dH₂O) 20 dk.
4. Bölümleri üç farklı hidroklorik asit (HCl) çözeltisine aktarın (1 dakika boyunca 0 ° C'de 1 M, RT'de 2 M 10 dakika ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de 2 M) 20 dakika boyunca RT'de 0.1 M sodyum tetraborat içinde nötralizasyondan önce 20 dakika.
5. PBS (yıkama tamponu) içinde seyreltilmiş% 1 Triton X-100'de 3 × 10 dakikalık inkübasyonlardan sonra, bölümleri RT'de 1 saat boyunca% 10 fetal sığır serumu (bloke etme çözeltisi) içeren yıkama tamponuna aktarın.
6. Bölümleri 48 saat boyunca 4 ° C'de 1:100 oranında bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş fare-anti-BrdU (5-bromo-2 '-deoksiuridin) içinde inkübe edin.
7. Bölümleri 3 × 10 dakika yıkama tamponunda yıkayın ve yıkama tamponunda 1:10 oranında seyreltilmiş at turpu peroksidaz içinde 48 saat inkübe edin.
8. Bölümleri 5 × 10 dakika boyunca PBS'ye aktarın ve ardından %0,02 H içeren benzer bir DAB çözeltisine aktarılmadan önce PBS'de seyreltilmiş %0,01 diaminobenzidin (DAB) içinde 0,02 dakika boyunca ₂O₂.
9. Bir dizi yıkamayı tamamlayın (PBS'de 2 × 10 dakika ve sodyum klorür eklenmeden fosfat tamponunda 2 × 10 dakika) ve bölümleri mikroskop slaytlarına sayısal sırayla monte edin.
10. Kresil menekşe ile karşı boyama yapmadan önce bölümleri yaklaşık 30 dakika kurulayın.
11. Mikroskop slaytlarını bir slayt rafına yerleştirin.
12. dH<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂O ve ardından slaytları dH₂O for 15 min.
13. Bölümler etanolde üç kez kurutulmadan önce adım 2.12'yi tekrarlayın (5 dakika boyunca %96 ve 2 × 2 dakika boyunca %99).
14. Bölümleri 2 × 15 dakika boyunca ksilene yerleştirin ve montaj için hızlı kuruyan bir ortam kullanarak slaytları kaplayın.
15. Son olarak, mikroskopi için kullanılmadan önce kapakla kaymış slaytları yaklaşık 24 saat bekletin.

3. Optik fraksiyonatör kullanılarak BrdU etiketli nöronların toplam sayısının tahmini

NOT: Analiz edilecek kesit sayısı ve örneklenen kesitlerdeki optik disektör sayısı gibi optimal numune alma parametrelerini belirlemek için birkaç hayvanı içeren bir pilot çalışma yürütün. Bu pilot uygulama aynı zamanda bir ön CV (standart sapma/ortalama) ve araştırmacı tarafından belirlenen tahminlerin tatmin edici bir kesinliğini elde etmek için CE'yi ayarlama imkanı sağlar (daha fazla ayrıntı için aşağıya bakın). Benzer şekilde, bir z-dağılımı analizi aşağıdaki noktaları ele alacaktır: doku büzülmesi, bölüm boyunca lekelenmenin kalitesi ve hücrelerin z eksenindeki dağılımı.

1. optik fraksiyonatörün kullanımına uygun olduklarını, örneğin koruma bölgeleri de dahil olmak üzere seçilen dissektörün yüksekliği için yeterince kalın olduklarını doğrulamak için bölümlerdeki dokunun kalınlığını kontrol edin (aşağıya bakın). NOT:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Doku kalınlığı, ilgilenilen bölge içinde birkaç yerde ölçülür.
   1. Slaytları mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin ve tercih edilen stereolojik yazılımı açın.
   2. 100X yağa daldırma hedefine geçmeden önce düşük büyütmeli bir hedef (2X veya 4X) kullanarak ilgi alanını tanımlayın (bkz. Figure 2A).
   3. Sayma çerçevesinin belirli bir noktasını kullanma (e., bir köşede veya bitişiğinde), odakta bir kesit özelliği görünene kadar odak düzlemi boyunca hareket ederek bölümün üst kısmını bulun. Bu z konumunu 0 olarak kaydedin (bkz. Figure 2B).
   4. Sayma çerçevesinin aynı spesifik noktası odaktaki dokunun son z seviyesine gelene kadar odak düzlemini doku boyunca aşağı doğru hareket ettirin ve bu konumu işaretleyin. Lokal doku kalınlığı 0'dan bu uç noktaya kadar tanımlanır ve z ekseninde okunabilir. Doku kalınlığını kaydedin (bkz. Figure 2B).
2. Lekenin tam penetrasyonunu ve hücrelerin bölümün tam kalınlığındaki dağılımını belgeleyin.
   NOT: <span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' >BrdU etiketli nöronların dağılımı, gerekli koruma bölgelerini belirlemek için bir kılavuz olarak kullanılır. Hücrelerin tek tip bir dağılımı kritik olsa da, bölümün üst ve alt kısımlarına yakın daha az hücre gözlemlemek kabul edilebilir, bu da kayıp kapakların etkisini gösterir.
   1. BrdU etiketli nöronları örnekleyin ve z-konumlarını, her sayma çerçevesinin seçilen köşesinde ölçülen yerel kesit kalınlığıyla birlikte kaydedin.
   2. BrdU-pozitif nöronların sayısını, z-pozisyonlarının bir fonksiyonu olarak çizin.
3. Yönetici ve koruma bölgelerinin yüksekliği, ortalama kesit kalınlığına ve hücrelerin dağılımına bağlı olarak sabitlenmelidir (bkz. 3.1 ve 3.2).
   NOTE: Yüzeylere yakın artefaktları önlemek için disektörün yüksekliği kesit kalınlığından daha az olmalıdır. Bu risk, bölümün üst ve alt kısımlarına koruma bölgeleri dahil edilerek atlatılır.
4. Sektörler arasındaki adım uzunluğunu belirleyin.
   1. Analiz edilecek tüm bölümlerde ilgilenilen bölgeyi tanımlayın ve alanları kaydedin.
   2. Bu alanları toplayın ve bu alana yerleştirilen disektör sayısına bölün.
      NOTE: Önceki deneyimlere dayanarak, iyi bir başlangıç noktası 75 prob gerektirir. Bu, alanı ve karşılık gelen örnekleme konumlarını yaklaşık olarak gösterir (A_step).
   3. A_step, x-y-adım boyutunu sağlar.
5. Sayma çerçevesinin boyutunu belirleyin.
   1. Sayma çerçevesinin boyutunu rastgele bir birime ayarlayın ve bölüm 3.3 ve 3.4'te elde edilen parametreleri kullanarak BrdU-pozitif nöronların pilot örneklemesini gerçekleştirin.
      NOTE: Boyut, deneme yanılma yoluyla ampirik olarak belirlenmelidir, ancak disektör başına 2-3 hücre örneklemesini sağlayacak şekilde ayarlanması önerilir.
6. Pilot çalışmanın bu son adımını takiben, hücre örneklemesine başlayın.
   NOT: <span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' >Elde edilen örnekleme parametreleri, verimli bir stereolojik tasarım elde etmek için yeterli olan her hayvanda yaklaşık 150-200 hücre sayımı ile sonuçlanmalıdır.
7. ×100 yağa daldırma hedefi ve son büyütme 2000-3000× kullanarak BrdU pozitif nöronları sayın. Her optik disektörde, ilgilenilen özellik tarafından tanınan herhangi bir BrdU etiketli nöronu tanımlayın (bu çalışmada, kriter, BrdU etiketli nöronun ön kenarının ilk kez odaklandığı zamandır), sayma çerçevesinin içinde yer alır veya inklüzyon çizgilerine dokunun (Figure 2B). Dissektör yüksekliği içindeki ilgilenilen özellik tarafından açıkça tanındığında dışlama çizgilerine dokunan BrdU-pozitif nöronları saymayın. Tüm stereolojik niceleme boyunca bu sayma kurallarını dikkatli bir şekilde takip etmek kritik derecede önemlidir.
   NOTE: BrdU tüm bölünen hücrelere dahil olduğundan, morfoloji nöronlar ve diğer hücre türleri arasında ayrım yapar. Nöron özellikleri, nötr bir sitoplazma ve karanlık bir nükleol ile açıkça tanımlanmış bir çekirdektir. BrdU pozitif hücreler, glial hücrelerden daha büyük boyutlarına dayanarak yeni oluşan nöronlar olarak tanınır. Kısa süreli proliferasyon çalışmalarında (ör., < 2,4 saat), olgunlaşmamış nöronal belirteçler kullanılarak çift boyama bir ön koşul olabilir.

Results

Materials