Floresan mikroskobu kullanılarak Drosophila pupa gözünün canlı görüntülenmesi

Özet

Source: Hellerman, M. B., et al. Drosophila Pupa Gözünün canlı görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)

Video, bir Drosophila melanogaster pupasında göz desenini incelemek için canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Yeşil floresan proteini (GFP) etiketli belirteçler, gelişmekte olan göz yapısının oluşumu sırasında hücresel organizasyonun ve farklılaşmanın görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

1. Floresan Görüntüleme

1. Drosophila pupa preparatını floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Her 7 dakikada bir, adherens kavşakları bölgesinde, göz nöroepitelinin apikal alanı boyunca seri kesitler yakalayın.
   NOT: a) Uygun seri kesitler genellikle 0,2 μm z-adımından oluşan z-yığını başına 4-5'tir. b) Hafif çarpmalar ve kıvrımlar da dahil olmak üzere epitel topolojisindeki düzensizlikler, geniş doku bölgelerinin odak içi görüntülerini elde etmeyi zorlaştırabilir. Görüntüleme yaparken, bir ilgi alanının bir kısmının odakta olduğunu ve komşu bir bölgenin odak dışında olduğunu görebilir. Pupa göz ile lamel arasına küçük bir damla damıtılmış su dahil etmek, bazı akut doku kıvrımlarını ortadan kaldırabilir, ancak pupa göz morfogenezinin erken evrelerinin hafif düzensiz topoloji karakteristiğini ortadan kaldıramaz. Bu durumlarda, tüm alan için odak içi dilimler elde edilene kadar z-yığınını genişleterek dokuyu aşırı örnekleyin. c) Her 7 dakikada bir seri kesitlerin yakalanması, görüntü kalitesini tehlikeye atabilecek yeşil floresan proteini (GFP) floresan yoğunluğunda önemli bir azalma olmadan 3 ila 4 saat boyunca canlı görüntülemeyi mümkün kılmalıdır. Daha kısa zaman aralıkları toplam görüntüleme süresini azaltabilir.
2. 3 ila 4 saat boyunca görüntülemeye devam edin. Pupa büyümesi ve hemolenfin pompalanması retinanın pozisyonunu hareket ettirdiğinden ve her 14-21 dakikada bir dikkatli yeniden odaklama gerektiğinden, birçok floresan mikroskobunda bulunan otomatik odaklama ve zaman fonksiyonunu kullanmayın.

NOT: 4 saatten fazla görüntüleme gözün morfogenezini yavaşlatabilir veya durdurabilir.

3. Arka planı azaltmak ve seri kesit görüntülerinin kontrastını artırmak için uygun evrişim giderme yazılımı kullanın. Her z-stack dosyası için Leica uygulama paketi gelişmiş floresan (LAS AF) yazılımında aşağıdakileri gerçekleştirin: Araçlar paneline gidin, 3D Evrişimi Giderme'yi seçin ve Uygula'yı tıklatın.
4. Her evrişimden arındırılmış yığın dosyası için bir maksimum projeksiyon (MP) görüntüsü oluşturun: Araçlar paneline gidin, 3D Projeksiyon'u seçin ve Uygula'yı tıklatın.
   NOT: MP algoritması, aşırı örneklenmiş doku için tek tip bir odak içi görüntü oluşturamayabilir.

2. Görüntü İşleme

1. {{}}Otomatik Görüntü Hizalama:

NOT: Canlı Drosophila dokusu görüntüleme süreci boyunca yer değiştirecek ve büyüyecektir. Sonuç olarak, ardışık zaman noktalarında toplanan görüntü merkezleri, Drosophila dokusundaki aynı noktaya karşılık gelmeyebilir. Ek olarak, tüm retina diski, puparium oluşumundan (APF) sonra ~ 21 ila 23 saat arasında yaklaşık 30 ° döner. Bireysel hücre davranışlarını vurgulamak ve organizma büyümesinin neden olduğu dikkat dağıtıcı unsurları azaltmak için her MP görüntüsünü hizalayın. Bu manuel olarak gerçekleştirilebilse de, burada kullanılan görüntü düzenleme yazılımı, süreci hızlandırabilen yerleşik algoritmalara sahiptir.

2. Ana menünün Dosya sekmesinden Komut Dosyaları'nı açın ve Dosyaları Yığına Yükle'yi seçin.
3. MP görüntü dosyalarını Katmanları Yükle paneline içe aktarın ve Tamam'ı seçin. Kaynak Görüntüleri Hizalamaya Çalış seçeneğinin otomatik olarak seçilmediğinden emin olun.
4. NOT: Bu seçenek seçilirse, yazılım görüntü verilerini bozan bir hizalama algoritması kullanabilir.
5. Tüm MP dosyaları Katmanlar bölmesine yüklendikten sonra, tüm görüntülerin en erken zaman noktası katman yığınının en üstünde olacak şekilde kronolojik sırada olduğundan emin olun. Katmanlar doğru sırada değilse, doğru şekilde sıralanana kadar sürükleyip bırakın.
6. Ana menünün Düzenle sekmesinden Katmanları Otomatik Hizala'yı seçin. Yeniden Konumlandır'ı seçin ve Tamam'ı tıklatın.
7. Otomatik Hizalama algoritması çerçeveleri ilgili bir odak noktasına yönlendiremezse, Taşıma aracını kullanarak küçük ayarlamalar yapın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b
25 x 75 x 1 mm cam mikroskop lamı	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm cam lamel	VWR	48393-172
Forseps	Güzel Bilim Araçları	91150-20
Whatman 3 mm kromatografi kağıdı	Fisher Scientific	05-713-336
Vazelin	Fisher Scientific	19-086-291
30 ml şırınga	Fisher Scientific	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Adobe
Leica TCS SP5 DM mikroskobu	Leica Microsystems
LAS AF Sürüm 2.6.0.7266 mikroskop yazılımı	Leica Microsystems