Floresan mikroskobu kullanılarak dura materdeki duyusal nöronların kökenlerinin araştırılması

Özet

Kaynak: Wang, J., {{}} ve diğerleri. İmmünofloresan ve Nöral İzleme ile Sıçan Kraniyal Dura Materinin Kalsitonin Geniyle İlişkili Peptit İmmünoreaktif İnnervasyonunun Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, floresan mikroskobu kullanarak dura materdeki duyusal nöronların kökenlerini izlemek için bir yöntem göstermektedir. Anestezi uygulanmış bir sıçanın açıkta kalan dura materine retrograd bir izleyici sokulur. İzleyici, duyusal nöronal aksonlar tarafından alınır ve trigeminal ganglion ve servikal dorsal kök gangliyonları içindeki hücre gövdelerine retrograd olarak hareket eder. Ganglionlar daha sonra kesitlere ayrılır, hücre gövdelerindeki izleyici ve nöropeptitleri etiketleyen antikorlarla boyanır ve duyusal nöronların ganglionik kökenlerini doğrulamak için floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Florogold (FG) ile retrograd izleme çalışması

1. Cerrahi işlemler
   1. Sıçan kraniyal dura materinde ilgilenilen koordinat alanını belirleyin.
   2. 10 μL'lik bir mikro şırınga hazırlayın ve sıvı parafin ile test edin.
   3. Sıçanları intraperitoneal enjeksiyon yoluyla tribromoetanol çözeltisi (150 mg / kg) ile uyuşturun. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmemesi nedeniyle anestezideki derinliği kontrol edin.
   4. Farenin kafasını elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin.
   5. Sıçanın üzerine künt kulak çubukları yerleştirin ve stereotaksik cihaza yerleştirin. Sonra ağız tutucuyu yerleştirin ve gözlere oftalmik merhem sürün.
   6. Kafa derisinin cerrahi bölgesini %10 povidon iyot ve ardından %75 etanol kullanarak temizleyin.
   7. Kafa derisinin orta hattı boyunca bir kesi yapın.
   8. Steril pamuk uçlu aplikatörler (Şekil 1A) kullanarak periost ve kas dokularını kafatasından künt bir şekilde çıkarın.
   9. Orta meningeal arterin (MMA) üzerindeki sol parietal ve temporal kemiklerde yuvarlak uçlu (#106) bir çapak matkabı kullanarak küçük bir delik (~5-7 mm) açın ve kraniyal dura materin sağlam tutulduğundan emin olun (Şekil 1B).
   10. İzleyicinin yayılmasını sınırlamak için diş silikat çimentosu ile deliğin etrafına bir set oluşturun (Şekil 1C).
   11. 10 μL'lik bir mikro şırınga ile MMA'nın etrafındaki deliğe 2 μL %2 FG ekleyin (Şekil 1D).
   12. Deliği küçük bir parça hemostatik süngerle kapatın.
   13. Deliğin üzerine bir parça parafin film koyun ve izleyicinin sızmasını önlemek ve çevredeki dokuları kirletmemek için kenarları kemik mumu ile kapatın.
   14. Yarayı steril iplikle dikin.
   15. Fareleri tamamen iyileşene kadar ılık bir yerde tutun.
   16. Fareleri kafeslerine geri koyun ve içme suyuna bir antibiyotik ve analjezik ekleyin.
2. Perfüzyonlar ve kesitler
   1. 7 hayatta kalma gününden sonra bu fareleri perfüze edin.
   2. Trigeminal ganglion (TG) ve C1-4 dorsal kök gangliyonlarını (DRG'ler) inceleyin, ardından bunları düzeltin ve kriyoproteksiyon yapın (Şekil 1F).
   3. TG ve DRG'leri bir kriyostat mikrotom sistemi üzerinde 30 μm kalınlığında sagital yönde kesin ve silan kaplı cam kızaklar üzerine monte edin.
3. TG ve DRG'lerde FG ve kalsitonin geni ile ilişkili peptit (CGRP) etiketlemesi için çift immünofloresanlar
   NOT: FG etiketlemesi, ek boyama olmadan cıva lambası altında ultraviyole (UV) aydınlatma ile doğrudan gözlemlenebilse de, FG'li etiketli nöronlar, ortaya çıkarmak için FG ve CGRP ile çift immünofloresan kullanılarak TG ve servikal DRG'lerde daha fazla incelendi. TG ve DRG'lerde dural CGRP-immünoreaktif sinir liflerinin kökenleri.
   1. Kesitleri histokimyasal kalemle daire içine alın.
   2. Bölümleri, 0.1 M fosfat tamponunda (PB) %3 normal eşek serumu ve %0.5 Triton X-100 içeren bir bloke edici solüsyonda 30 dakika inkübe edin.
   3. Numuneleri, 4 ° C'de gece boyunca% 1 normal eşek serumuve% 0,5 Triton X-100 içeren 0,1 M PB'de tavşan anti-florogold (1:1000) ve fare anti-CGRP antikoru (1:1000) çözeltisine aktarın.
   4. Ertesi gün bölümleri 0,1 M PB'de üç kez yıkayın.
   5. Eşek anti-tavşan Alexa Fluor 594 (1:500) ve eşek anti-fare Alexa Fluor 488 (1:500) ikincil antikorunun karışık bir çözeltisinde% 1 normal eşek serumu ve% 0.5 Triton X-100 içeren 0.1 M PB'de 1.5 saat boyunca inkübe edin oda sıcaklığında.
   6. Bölümleri yıkayın ve lamelleri uygulayın.
4. Gözlem ve kayıt
   1. Dijital kamera ile donatılmış floresan mikroskop ile TG ve DRG'lerdeki FG işaretli nöronların UV aydınlatması altında görüntülerini alın.
   2. Dijital kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında TG ve DRG'lerdeki FG ve CGRP etiketli nöronların görüntülerini yakalayın.
   3. Görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlamak ve resimlere etiket eklemek için düzenleme yazılımını kullanın.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alexa Fluor 488 eşek anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Işıktan koruyun; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Sürüm 1.1	Floresan mikroskop yazılımı
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from ışık<
Fluoresan imaging system	Olympus	BX53<
Donma mikrotom	Thermo	Microm InternationalGmbH
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal eşek serumu	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Işıktan koruyun
Photoshop ve İllüstrasyon	Adobe	CS6	Fotoğraf düzenleme yazılımı
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013<
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm

tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>