Konfokal mikroskopi kullanılarak zebra balıklarında lazerle ablasyonlu internöromast hücrelerinin iyileşmesinin izlenmesi

Özet

Kaynak: Volpe, B. A., et al. Zebra Balığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Testi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 31}} (2020)

Bu video, konfokal mikroskopi kullanarak zebra balıklarında internöromast hücre iyileşmesinin izlenmesini, hızlandırılmış floresan görüntüleme yoluyla hücre ölümünü ve onarımını izlemeyi göstermektedir.

Protokol

1. Rejenerasyonu incelemek için ablasyon sonrası görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskopi

1. "Kanallar" için açılır menüye tıklayın. Kanallarda, ablasyon lazerini etkisiz hale getirmek için "DAPI"(4",6-diamidino-2-fenilindol) izinin işaretini kaldırın. "Edinme modu" için açılır menüye tıklayın.
2. Edinme modunda, "Zoom" seçeneğine tıklayın.
3. Kaydırıcıyı kullanarak veya "0.7."
   1. } yazarak yakınlaştırmayı 0,7'ye düşürün.
      NOT: Hedeflenen hücre veya hücrelerde GFP (Yeşil floresan proteini) görünmemelidir. Ablasyon öncesi görüntüleme için açıklananlarla aynı veya benzer ayarları kullanarak, ablasyon sonrası bir görüntü yakalayın ve kaydedin (Şekil 1C). Görüntü, floresan hücrelerin kalıntılarını veya çıkarılması gereken ek hücre gövdelerini ortaya çıkarırsa, internöromast hücre dizisinde görünür bir boşluk oluşturmak için lazer ablasyon adımlarını tekrarlayın.
   2. Hücresel hasarı daha fazla doğrulamak için T-PMT (İletim Fotoçoğaltıcı Tüp) kanal görüntüsünü inceleyin. Hasarlı hücreler tanecikli bir görünüme sahip olacak ve çekirdekler sıklıkla şişecek veya şekli düzensiz hale gelecektir (Şekil 2).
4. Bir ön ablasyon görüntüsü yakaladıktan, hücreleri gerektiği gibi kestikten ve her bir aşama konumu için bir ablasyon sonrası görüntü yakaladıktan sonra, görüntü yakalama için hem aşama konumunu hem de zaman seçeneklerini etkinleştirerek hızlandırılmış mikroskobu ayarlayın. Zaman parametrelerini 24 saat veya istenen başka bir uç nokta ve 15 dakikalık aralıklarla ayarlayın. Görüntüleri almak için denemeyi başlatın ve tamamlandığında ortaya çıkan dosyayı kaydedin (ertesi gün).
5. Larvalar daha fazla incelenecek veya yetiştirilecekse, ince forseps kullanarak onları agarozdan dikkatlice çıkarın, ardından geri kazanım için trikain içermeyen E3 ortamına aktarın. Daha fazla kullanılmayacaklarsa, onaylanmış hayvan protokolüne göre ötenazi yapın (bir buz banyosuna hızlı ve sürekli daldırma yaygın bir yöntemdir) ve bunları kurumun gerektirdiği şekilde atın.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12-well PTFE Printed Slides	Elektron Mikroskobu Bilimleri	63425-05
15 mM Trikain stok çözümü	Sigma	E10521	15 mM Trikain in in reverse osmosis water
1X E3 + 600 μM Tricaine			15X E3 ortamında 15 mM Trikain stoğunu 25X seyreltin
1X E3 media			60X E3 ortamını ters ozmoz suyunda (16,7 ml/L) 1X'e seyreltin
60 X E3 media	Sigma-Aldrich'ten satın alınan tüm bileşenler		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 litre ters ozmoz su
Bx60 Bileşik mikroskop cıva ark lambası floresansı	Olympus
405 nm, 488 nm ve 555 veya 561 nm lazerlerle donatılmış LSM 700 konfokal mikroskop	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Ablasyon için 5 mW 405 nm lazer kullanıldı; Ablasyonlar ve görüntüleme, NA değeri 1.40
FIJI/ImageJ Image processing software	Birden çok katılımcı		https://fiji.sc/
Saç bıçağına modifiye edilmiş diseksiyon iğnesi	Fisher Scientific	19010	Ahşap saplı bir diseksiyon iğnesinin ucuna bir kirpik yapıştırıldı
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google sheets, Microsoft Excel'e ücretsiz bir alternatiftir
1,5 no'lu lamel ile cam alt 35 mm tabaklar, 20 mm window	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm petri kabı, 20 mm cam pencere
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
74 um Polyester Örgülü Corning Netwell Insert, 24 mm Insert	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Indirilebilir https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereo mikroskop	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC

style='height:20px;'>