Bir Fare Kolonik Myenterik Pleksusunda Enterik Nöron ve Glia Aktivitelerinin Kalsiyum Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca²⁺ Enterik sinir sisteminin görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video kalsiyumu göstermektedir fare Kolonik Myenterik pleksus preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini görselleştirmek ve analiz etmek için görüntüleme.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik incelemesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Komite.

1.Prepare Değiştirilmiş Krebs arabelleği.

Bileşenlerin nihai konsantrasyonları (mM cinsinden) aşağıdaki gibi olacak şekilde değiştirilmiş bir Krebs tamponu yapın: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃, 1 pirüvik asit ve 8 glikoz (NaOH ile pH 7.4'e ayarlanır). Kas kasılmalarını engellemek için 3 μM nikardipin ve 1 μM skopolamin ekleyin²⁺ görüntüleme ve tam montajlı diseksiyonlar.

2. Görüntüleme ve Analiz

NOT: En azından bir floresan ışık kaynağı, mikroskop, kaliteli bir CCD kamera ve uygun bir edinme yazılımı olan temel bir görüntüleme teçhizatı kullanın. Işık kaynağına ve özel uygulamaya bağlı olarak diğer bileşenlerin eklenmesini değiştirin. Geleneksel bir ksenon ark ışık kaynağı ile bir filtre tekerleği ve deklanşör kullanılmalıdır. Ancak, LED ışık kaynakları ve aydınlatma sistemleri bu bileşenlere ihtiyaç duymaz.

1. Kayıt odasını mikroskop altına yerleştirin ve birden fazla ısıtılmış şırınga rezervuarına sahip bir yerçekimi akış perfüzyon sistemi kullanarak 2–3 ml/dk 37 °C Krebs tamponunda sürekli bir perfüzyon hızı oluşturun. Bir vakum kapanına bağlı hem giriş hem de emiş hattında hava kabarcığı oluşumunu önlediğinizden emin olun.
2. Parlak alan aydınlatması altında istenen pleksusu odak noktasına getirin. Foto ağartmaya yol açabilecek dokuyu aşırı maruz bırakmaktan kaçının.
3. Ganglionlar içindeki Fluo-4 yüklemesini inceleyin ve görüntüleme için sağlıklı gangliyonları seçin. Sağlıksız / hasarlı ganglionlar otofloresan veya punktat morfoloji sergileyecektir ve görüntüleme için kullanılmamalıdır.
4. Ganglion seçildikten sonra, ışık yolunu kameraya yönlendirin ve görüntü elde etme yazılımı ile canlı görüntü elde edin. Ganglionun odakta olduğundan emin olun ve görüntü alma oranını ve pozlama sürelerini ayarlayın.
   NOT: <span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' >Görüntü elde etme oranları ve süreleri, araştırmacıların kaydetmek istediği olaylara bağlı olarak değişecektir. Çoğu deney için, görüntüler geleneksel olarak glial hücreler için 0,5-1 Hz'de ve nöronlar için 2-10 Hz'e kadar elde edilir çünkü glial Ca²⁺ yanıtlar Ca²⁺ nöronlardaki geçici olaylar.
5. Deneye başlayın ve 30 saniye boyunca temel aktivite oluşturun.
6. Reseptör agonistleri ve antagonistler gibi önceden ısıtılmış ilaçları yerçekimi akışı perfüzyon sistemini kullanarak 2-3 ml / dk hızında uygulayın. Normal tampon perfüzyonuna dönerek agonistlerin / antagonistlerin uygulanmasını takip edin ve en az 10 dakikalık bir yıkama / geri kazanım periyoduna izin verin.
   NOTE: İlaç uygulama süreleri, bireysel bileşiğe ve deneysel tasarıma bağlı olarak değişecektir. Genel olarak, nöronlarda ve glial hücrelerde G-proteinine bağlı reseptörleri aktive etmek için 20-30 saniyelik bir agonist uygulaması yeterlidir. Bununla birlikte, ligand kapılı iyon kanalları (nikotinik asetilkolin reseptörleri gibi) 5-10 saniyeden fazla olmayan uygulama süreleri gerektirir. Daha uzun süreli maruziyetler, ligand kapılı iyon kanallarının hızla duyarsızlaşmasına neden olacaktır. Reseptör yollarının tam blokajını sağlamak için antagonistler yaklaşık 3-15 dakika boyunca uygulanmalıdır. Bununla birlikte, bu büyük bir genellemedir ve araştırmacılar her zaman herhangi bir deneysel ilacı kendi özel paradigmalarında optimize etmelidir.
7. Kaydı durdurun ve deneyin hızlandırılmış videosunu izleyin. Uygun görüntü analiz yazılımını kullanarak ilgi alanlarını (ROI'ler) dikkatlice seçin.
8. ROI floresan yoğunluğunu normalleştirmek ve başlangıçtaki temel floresan değeriyle karşılaştırmak için yazılım kullanın. Normalleştirilmiş floresanstaki değişiklikler, [Ca²⁺].
   1. Değerlendirme doğruluğunu artırmak için ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background kullanarak daha önce açıklanan bir yöntemin modifikasyonunu kullanın, burada F1 herhangi bir noktadaki floresan ve F0 temel floresandır. Bu modifikasyon, myenterik pleksusun altındaki kas tabakasının hareketini sergileyen doku preparatlarındaki floresan değişikliklerinden kaynaklanan gürültünün azaltılmasına yardımcı olur.

Malzemeler