$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Astrositlerin İyontoforez ile Doldurulması
- Elektrodu test edin.
- Oda sıcaklığında 0,1 M PBS ile doldurulmuş cam tabanlı bir tabağa bir beyin dilimini nazikçe yerleştirin. Dilimi naylon ipli platin bir arp ile yerinde tutun.
- Elektrotun bir voltaj kaynağına bağlı olduğundan emin olun ve toprak elektrodunu beyin dilimini içeren banyoya yerleştirin.
- Hedefi ilgilenilen beyin bölgesine taşıyın.
- Elektrodu çözeltiye indirin. Parlak alanın altında, görüş alanının merkezine taşıyın ve net göründüğünden ve kalıntı veya kabarcık olmadığından emin olmak için 40x suya daldırma lensi ile dikkatlice inceleyin. Elektrot ucunu tıkayan herhangi bir şey varsa, yenisiyle değiştirin.
NOT: Tıkanma, 200 MΩ elektrot için bir endişe kaynağıdır. Her deneyden önce boya çözeltisinin santrifüjlenmesi ve süzülmesi ile bu sık karşılaşılan bir sorun olmamalıdır. Bununla birlikte, elektrotun ucu küçük olduğu için, doku bazen açıklığa sıkışabilir. Yazarlar bunu önlemenin bir yolunu bulamadılar, ancak sadece yeni bir elektrot kullanarak kolayca ele alınabilir. - Parlak alanın altında, elektrotu yüzeyin hemen üzerinde duran dilime doğru yavaşça indirin.
- Astrositi iyontoforez ile doldurun.
- Kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) ile dilim yüzeyinin 40−50 μm altındaki astrositleri tanımlayın. Çapı yaklaşık 10 μm olan uzun, oval şekilli somatalı hücreleri arayın. Bir astrosit seçildikten sonra, onu görüş alanının merkezine taşıyın.
NOT: İyontoforez için iyi bir hücrenin etrafında net, tanımlanmış sınırlar vardır. Dilimin yüzeyine çok yakın hücreler seçmeyin, çünkü bunlar tamamen doldurulamaz. Boya dolgusu için astrositleri rutin olarak tanımlayabilmek için birkaç gün içinde biraz pratik yapmak gerekir. Deney için kullanılan beyin bölgesine bağlı olarak, astrositlerin sayısı değişebilir. Bu, doldurmadan önce bir astrositi tanımlamak için gereken süreyi etkileyebilir. - Elektrot ucunu, hücre gövdesi ile aynı düzlemde olana kadar doku boyunca ilerleyerek yavaşça dilimin içine indirin.
NOT: Dokuya zarar vermemek için elektrodu yavaşça hareket ettirin. - Astrositin hücre gövdesi açıkça görülüp ana hatları çizildikten sonra, elektrodu yavaşça ve nazikçe ileri doğru ilerletin. Elektrodu, uç hücrenin soma'sını kazığa oturtana kadar hareket ettirin. Elektrotun soma içinde olup olmadığını not etmek için objektifin odağını yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin.
NOT: Elektrot ucu hücre gövdesinin içinde olmalı ve soma üzerinde küçük bir girinti gözlenmelidir. Ucun hücreden geçmesini önlemek için elektrodu daha fazla hareket ettirmeyin. - Elektrot ucu hücrenin içine girdikten sonra, stimülatörü ~ 0.5−1 V'ta açın ve hücreye sürekli olarak akım verin. Konfokal mikroskobu kullanarak hücre dolmasını izleyin. Hücrenin ayrıntılarını görmek için dijital yakınlaştırmayı artırın ve elektrotun ucunun hücre içinde görünür olduğundan emin olun.
NOT: Boyanın hücreden sızdığı veya çevredeki diğer hücreleri doldurduğu görülüyorsa voltajı düşürün. Boya hala hücreden sızıyor gibi görünüyorsa, elektrodu yavaşça dışarı çekin ve başka bir hücre bulun. Son görüntüde yüksek bir sinyal/arka plan oranına sahip olmak için boyanın sızıntı yapmaması önemlidir. - Daha ince dallar ve süreçler tanımlanmış görünene kadar yaklaşık 15 dakika bekleyin, voltajı kapatın ve elektrot ucunu hücreden yavaşça çekin.
- Doldurulmuş hücreyi görüntüleyin.
NOT: Dolgudan hemen sonra görüntüleme yapılabilir. Daha yüksek sayısal açıklığa (NA) sahip bir objektif, daha iyi çözünürlük sağlar. - 40x objektif ile görüntülemeden önce (15-20 dk) hücrenin orijinal formuna dönmesini bekleyin. Hücreyi görüntülemek için, daha ince dalların ve işlemlerin tanımlı göründüğünden emin olmak için odak üzerindeki ayarı yapın.
- 0,3 μm'lik adım boyutuna sahip bir z yığını ayarlayın. Görüntüleme sırasında, hücreden sinyal gelmeyene kadar hedefi hareket ettirin ve bunu en üst olarak ayarlayın. Ardından, sinyal kalmayana kadar hedefi aşağı hareket ettirin (hücreye odaklanarak), bunu alt olarak ayarlayın.