Sirkadiyen Saat Nöronlarının Hızlandırılmış Görüntülenmesi için Drosophila Beynini Bir Matrise Yerleştirme

Özet

Kaynak: Sabado, V. , et al., Nagoshi, E. Drosophila {{}}Larva Beynindeki Sirkadiyen Saatler Kültür. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, Drosophila beynini bir fibrin matrisine yerleştirme prosedürünü ve ardından aydınlık/karanlık döngüleriyle senkronize ritmik aktiviteyi analiz etmek için sirkadiyen saat nöronlarının hızlandırılmış floresan görüntülemesini gösterir.

Protokol

1. Beyin eksplantlarının bir 3D matrise gömülmesi ve montajı (~ 20 dk).
   1. Disseke edilmiş bir beyni fibrinojen çalışma solüsyonuna (fibrinojen nihai konsantrasyonu ~ 3.3 mg / mL, beyin başına 10.5 μL) aşağıdaki gibi daldırın:
   2. 3.5 μL schneider aktif ortam (SAM) / antibiyotik aspire edin. Diseksiyondan diseksiyondan iyi bir şekilde aspire edin, uçta SAM / antibiyotik ortamını dağıtmadan.
   3. Beyni ve ortamı steril bir Petri kabının kapağına dağıtın. Beyni içeren damlaya 3.5 μL SAM / antibiyotik ve 3.5 μL ılık fibrinojen / SAM 10 mg / mL çözeltisi ekleyin. 20 μL'lik bir pipet ucuyla pipetleyerek solüsyonu beynin etrafında nazikçe karıştırın.
      NOT: Bu adımda forseps yerine pipet kullanmak beyni strese sokmaktan kaçınır.
   4. Damladan 2 μL fibrinojen çalışma solüsyonu alın ve cam tabanlı tabağın lamel üzerine küçük bir daire şeklinde uygulayın. 0.8 μL trombin ekleyin ve bir pipet ucu ile çok hızlı bir şekilde karıştırın. Fibrinojen fibrine dönüştürülür ve polimerleşmeye başlar.
   5. Fibrinojen çalışma solüsyonunda ( adım 1.1) bir çift forseps arasında bulunan beyni alın ve beyaz bir fibrin matrisi göründüğünde matris üzerine yerleştirin. Beynin ön tarafını aşağı doğru yönlendirin (saat nöronlarını görüntülemek için). Kapak camına mümkün olduğunca yakın bir yere bastırın. Fibrin pıhtısı, fibrin katmanlarından oluşur. Bir katman seçin ve matrisi ayırmadan küçük ve yumuşak hareketlerle beynin üzerine katlayın.
      1. Beyni stabilize etmek için pıhtının farklı bölgelerinden 2 ila 3 kez tekrarlayın.
         NOT: Beyni forseps ile tutarken, kurutmamaya veya üzerine fiziksel baskı uygulamamaya dikkat edin.
   6. Trombinin etkisini durdurmak için gömülü beynin üzerine 20 μL SAM / antibiyotik ekleyin.
   7. Kalan beyinleri monte etmek için prosedürü tekrarlayın. Cam tabanlı bir tabağa beş ila altı adede kadar beyin yerleştirilebilir.
   8. Uzun süreli canlı görüntüleme için, iç kuyucuğa (cam kısım) 600 μL SAM / antibiyotik ekleyin. Ortamın üzerine önceden kesilmiş bir Politetrafloroetilen (PTFE) membran yerleştirin ve tabanın plastik kısmına uygulanan vakumlu grese yapıştırın (Şekil 1A).

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Laboratuvarda sahip olduklarımızla tam olarak aynı olduklarından emin değilim. Mümkün olduğunda "böcek hücre kültürü için uygun" seçeneğini seçtim
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Maya özü	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(-(-Malik asit	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trehaloz dihidrat	Sigma-Aldrich	T0167
Süksinik asit	Sigma-Aldrich	S9512
Fumaric acid	Sigma-Aldrich	F8509
α-ketoglutaric acid	Sigma-Aldrich	K1128
Isı ile inaktive edilmemiş, Fetal Buzağı Serumu (FCS) Mikoplazma ve Virüs taramalı	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich<
Sığır plazmasından fibrinojen	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	DİKKAT: Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda zararlıdır. Laminer akış altında manipüle
Sığır plazmasından trombin	Sigma-Aldrich<	DİKKAT: Sağlık Tehlikesi, eldiven kullanın
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Vakumlu gres	Sigma-Aldrich	18405
35 mm Çanak, No. 1.5 Lamel, 20 mm Cam Çapı, Kaplamasız	MatTek	P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Kolay Kavramalı Doku Kültürü Yemekleri	Fisherscientific	08-772A
Steril 500 mL Steritop-GP 33 mm dişli şişe üstü filtre, 0,22 μm	Millipore	SCGPS05RE
Politetrafloroetilen (PTFE) film	Dupont	200A Teflon FEP Film
Millex-HV Şırınga Filtre Ünitesi, 0,45 μm, PVDF, 33 mm, gama sterilize	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV Şırınga Filtre Ünitesi, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, gama sterilize	Millipore	SLGV033RS
Üç kuyulu cam diseksiyon tabağı	Any company
İnce forseps, boyut 5, Dumont	Fine Science Tools	11254-20
Tandem tarayıcı ters TCS SP5 konfokal mikroskop, rezonans tarayıcı ve HyD foto-çarpan dedektörleri ile	Leica microsystem CMS GmbH
Sıcaklık kontrol odası	Life Imaging Services	CUBE & BOX sıcaklık kontrol sistemi, özel tasarlanmış
Sahne üstü nem kontrolörü	Life Imaging Services	custom made
Suya Daldırma Mikro Dispenser: dağıtıcı, genişletilmiş mikro pompa MP6 serisi ve Otomatik Daldırma Objektif Kontrol yazılımı <
SUM-stack oluşturma ve 3D düzeltme drift eklentisi	ImageJ software
10x yinelemeli evrişim	AutoQuant ve Imaris software

)td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:12pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>S7903 ettd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:12pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>T9549td style='background-color:#ffffff; Renk: #1a202c; yazı tipi ailesi:Roboto; yazı tipi boyutu: 12pt; font-weight:normal; taşma:gizli; dolgu: 0 piksel 3 piksel; dikey hizalama: alt; beyaz boşluk: normal; sözcük kaydırma:kesme sözcüğü; sarma-stratejisi:4;' >Leica microsystem CMS GmbH bozukluğu