$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücrelerin kaplanması
NOT: Deneyime dayanarak, embriyo başına yaklaşık 100.000 canlı hücre toplanır. 2-3 aylık zamanlanmış hamile fareler tipik olarak 8-10 embriyoluk çöp boyutlarına sahiptir; Bu nedenle, zamanlanmış hamile fare başına toplam hücre verimi için kaba bir tahmin yaklaşık 1 milyon hücredir.- Bir hemositometre kullanarak bir hücre sayımı yapın ve ardından hücre kültürü ortamını kullanarak süspansiyonu 2.000 hücre/μL'ye seyreltin. Karıştırmak için kısaca ezin.
- Laminin solüsyonu ile lamelleri inkübatörden çıkarın ve kalan laminin solüsyonunu bir vakum kullanarak kaplanmış lamellerden aspire edin. Lamellerin tamamen kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde plakalayın. Her lamel üzerine 100 μL (2,0 x 105 hücre/lamel ) pipetleyin ve Petri kaplarını 1 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Her tabağa dikkatlice 3 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve 37 °C inkübatöre geri koyun. Preform yarım orta 2 hafta boyunca haftada 2 kez değişir.
2. Adeno-ilişkili viral (AAV) vektörlerle 14 (in vitro gün) DIV'de hücre kültürünün enfeksiyonu
- Her yemek için 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 1013 titre) ile 1 mL serumsuz DMEM ortamı hazırlayın
- Hücre kültürü ortamını her tabaktan aspire edin ve hSyn-GCaMP6f içeren 1 mL serum içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) ile değiştirin. Bulaşıkları 37 °C'lik inkübatöre 1 saat geri koyun.
- AAV'ler içeren serum serbest ortamını aspire edin ve 3 mL hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Bulaşıkları 37 °C'lik inkübatöre geri koyun. 5-7 günlük AAV enfeksiyonunun ideal GCaMP ekspresyonu seviyelerine izin verdiğini bulduk. Bu viral enfeksiyon dönemi boyunca her 2-3 günde bir ortam değiştirmeye devam edin.
3. 19-21 gün arasında canlı konfokal Ca2+ görüntüleme in vitro (DIV)
NOT: Viral enfeksiyonu takiben 5-7 gün arasında görüntüleme yapılabilir. Bu, spontan Ca2 + aktivitesinin saptanmasına izin veren seviyelerde floroforun görünür ifadesini elde etmek için ideal bir penceredir.
- Preparation of recording buffers
- 1 L HEPES kayıt tamponu yapmak için şunu ekleyin: 9.009 g NaCl, 0.3728 g KCl, 0.901 g D-glikoz, 2.381 g 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 2 mL 1 M CaCl2 stok çözeltisi ve 500 μL 1 M MgCl2 stok çözeltisine 800 mL steril damıtılmış H2O. NaOH ile pH'ı 7.4'e getirin. 1 L'lik son hacme getirin.
- 200 mL 20 μM glutamat kayıt tamponu yapmak için, 40 μL 100 mM glutamat stok çözeltisini yukarıda açıklanan 200 mL HEPES kayıt tamponuna seyreltin.
- Confocal imfokal imaging
- 35 mm'lik steril bir Petri kabını 3 mL kayıt arabelleği ile doldurun.
- 37 °C inkübatörden enfekte kültürler içeren 35 mm'lik bir Petri kabını çıkarın. İnce uçlu forseps kullanarak, bir lamel kenarını dikkatlice tutun ve hızlı bir şekilde kayıt tamponu ile doldurulmuş Petri kabına aktarın. Kalan lameli orta ortamdaki 37 °C inkübatöre geri yerleştirin. Çanağı kayıt tamponu ile konfokal mikroskoba taşıyın.
- Görüntüleme yazılımını başlatın. Başlatılırken bir sonraki adıma geçin.
- Peristaltik pompayı başlatın ve hattı kayıt arabelleğine yerleştirin. Akış hızını 2 mL/dk olacak şekilde kalibre edin.
- Enfekte olmuş lamel 35 mm Petri kabından kayıt banyosuna aktarın.
- 10x suya daldırma objektifini ve parlak alan (BF) ışığını kullanarak odak düzlemini bulun ve yüksek yoğunluklu nöron hücre gövdelerine sahip bir bölge arayın. 40x suya daldırma hedefine geçin ve numuneyi yeniden odaklamak için BF ışığını kullanın.
- FluoView içindeki "Boyalar listesi" penceresinde AlexaFluor 488'i seçin ve uygulayın.
- AAV ifadeleri değişken olabilir; bu nedenle, floroforların aşırı maruz kalmasını ve foto-ağartılmasını önlemek için düşük HV ve lazer gücü ayarlarıyla başlayın. AlexaFluor 488 kanalı için yüksek voltajı (HV) 500'e, kazancı 1x'e ve ofseti 0'a ayarlayın. 488 lazer çizgisi için gücü %5'e ayarlayın. Z düzleminde görüntülenen etkin hacmi artırmak için iğne deliği boyutunu 300 μm'ye yükseltin. Emisyon sinyallerini alt doygunluk seviyelerine en iyi şekilde ayarlamak için "odak x2" tarama seçeneğini kullanın. Buradan, her kanalın ideal görünürlüğü elde edilene kadar ayarlar yapılabilir.
NOT: GCaMP ile tüm Ca2+ akı aralığını doğru bir şekilde yakalamak için, dedektörü aşırı doygunlaştırmadan floresan yoğunluğunda bir artışa izin vermek için temel HV ve lazer gücü ayarlarını yapın. - Mikroskop ayarları optimize edildikten sonra, GCaMP6f floresansında spontan değişiklikler gösteren birden çok hücrenin bulunduğu bir bölgeyi bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için istenen düzleme odaklanın.
- Görüntü çerçevesini 1 saniyenin biraz altında bir kare aralığı elde edebilecek bir boyuta kırpmak için "Klip düzeltme" aracını kullanın. Bu, görüntüleme aralığını saniyede 1 kare olarak ayarlamak için gereklidir.
- "Interval" penceresini 1.0 değerine ve "Num" penceresini 600 değerine ayarlayın.
NOT: İstenen zaman noktasında (300 sn) farklı kayıt arabellekleri sağlamak için, yeni çözeltiyi banyoya iletmek üzere pompanın gecikmesini kalibre etmek önemlidir. Bu, çözelti perfüzyon hızına (2 mL / dak) ve çözeltiyi pompalamak için kullanılan hattın uzunluğuna bağlı olacaktır. - T serisi bir film çekmek için "Zaman" seçeneğini seçin ve ardından görüntülemeye başlamak için "XYt" tarama seçeneğini kullanın.
- Görüntüleme ilerleme çubuğunu izleyin ve hattı HEPES kayıt tamponundan uygun zaman noktasında 20 μM glutamat kayıt tamponuna taşıyın (örneğin, pompanın gecikmesi 60 s'de çözelti verecek şekilde kalibre edilmişse, 300 s'de glutamat vermek için hattı 240 karede glutamat tamponuna taşıyın).
- Görüntüleme tamamlandığında, Seri Bitti düğmesini seçin ve bitmiş t serisi filmi kaydedin. 20 μM Glutamat'ı 5 dakika daha perfüze etmeye devam edin, böylece kültürlenmiş nöronlar toplam 10 dakika boyunca glutamata maruz kalır. Görüntülenecek her lamel için bu işlemi tekrarlayın.
- 20 μM Glutamat'a 5 dakika daha maruz kaldıktan sonra, lameli banyodan çıkarın ve görüntüleme günü tamamlanana kadar kayıt tamponu içeren 35 mm Petri kabına geri koyun.