Kısa Süreli ve Uzun Süreli Sıçan Hipokampal Kültürlerinde İn Vitro Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Kaynak: Calvo-Rodríguez, et al. Yaşlı hipokampal nöronlarda hücre altı Ca²⁺. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, kısa ve uzun süreli sıçan hipokampal kültürlerinde sitozolik kalsiyum seviyelerini ölçmek için floresan görüntülemenin kullanımını göstermektedir. Genç ve yaşlı nöronları karşılaştırarak, yaşlı nöronlarda artan L tipi voltaj kapılı kalsiyum kanal yoğunluğunun ve uzun süreli aktivasyonun, nöronal yaşlanmanın ayırt edici bir özelliği olan kalsiyum aşırı yüklenmesine nasıl yol açtığını vurgular. Floresan kalsiyum göstergeleri, stimülasyon üzerine floresan yoğunluğundaki değişiklikler yoluyla bu farklılıkları ortaya çıkarır.

Protokol

1. Sıçan Hipokampal Nöronlarının Kısa ve Uzun Süreli Kültürü

1. Poli-D-lizin kaplı, 12 mm cam lamellerin hazırlanması.
   1. 12 mm çapındaki cam lamelleri etanolde en az 24 saat sterilize edin. Steril koşullar altında kurumaya bırakın.
   2. Lamelleri bir Petri kabında bir parafilm şeridi üzerine dağıtın. Her lamel yüzeyini 200 μl 1 mg / ml poli-D-lizin ile kaplayın. Gece boyunca tedaviye izin verin (O / N).
   3. Ertesi gün lamelleri steril koşullarda 90 dakika boyunca her 15 dakikada bir çift distile steril su ile yıkayın.
   4. Dört kuyucuklu çok çanaklı bir plakayı oyuk başına 500 μl Nörobazal Kültür Ortamı ile doldurun. Nörobazal Kültür Besiyeri% 10 fetal sığır serumu,% 2 B27, 1 μg / ml gentamisin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmelidir.
   5. Lamelleri çok tabaklı tabağa yerleştirin. Onları nemlendirilmiş 37 ºC ve %5 CO style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'₂ inkübatörünü kullanana kadar.
2. Yenidoğan sıçanlarından hipokampal nöronların izolasyonu.
   1. Steril koşullar altında bir flakonda (20 μl/ml) 1,8 ml papain solüsyonu (doğrudan satın alınır) hazırlayın: 20 μl/ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1,8 ml Hank's artı %0,6 sığır serum albüminine yaklaşık 40 μl papain ekleyin (BSA, μl tedarikçi koşullarına bağlı olarak hesaplanmalıdır). Hank'in% 0.6'lık BSA'sı, 85 ml Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ortamının 15 ml% 4 sığır serum albümini (BSA, 100 ml HBSS'de 4 g BSA'yı çözerek hazırlanır) karıştırılmasıyla hazırlanır. Steril bir kapüşonda hazırlayın.
   2. Papain'i kullanmadan önce Hank's plus% 0.6 BSA'da 30 ºC'de 37 dakika inkübe edin. Kullanmadan önce 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak çözeltiyi filtreleyin.
   3. Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium tozunu (L başına 13,5 g) 900 ml çift damıtılmış steril suya ekleyerek Jambonun F-12 ortamını hazırlayın. Sonra 6 g 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve 336 mg NaHCO₃ ve NaOH 4 N kullanarak pH'ı 7.42'ye ayarlayın. 1 L'lik bir çözelti elde etmek için steril su ekleyin ve 0.20 μm polietersülfon (PES) şişe üstü filtre kullanarak süzün. Bu işlemi steril bir başlıkta taşıyın. Son olarak çözeltiyi CO₂. Solüsyonları 4 ºC'de saklayın ve soğutulmuş olarak kullanın.
   4. Yenidoğan (P0) sıçan yavrularını dekapitasyon ile ötenazi yapın ve kafayı steril HBS ortamında yıkayın. Steril makas yardımıyla kafatasını açın. Beyni bir spatula ile çıkarın ve Ham'ın F-12 ortamında hızlıca yıkayın.
   5. Her yarım kürede bir neşter yardımıyla çapraz bir kesim yapın (Figure 1B) ve onu Ham'ın F-12 ortamını içeren bir Petri kabına taşıyın.
   6. Meninksleri diseksiyon forsepsleri yardımıyla ve bir büyüteç altında dikkatlice atın.
   7. Büyüteç kullanarak korteks üzerinde karakteristik bir içbükey konumda hipokampusu tanımlayın. Ardından, bir kenardan dikkatlice çekerek ve göz makası kullanarak yerinden çıkararak hipokampusu korteksten ayırın.
   8. Hipokampal dokuyu steril Hank'in Ca style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺ and Mg²⁺ artı %0,6 BSA ve yıkama hipokampal dokusu. Ortamı çıkarmadan, aynı göz makasını kullanarak dokuyu küçük parçalar halinde (yaklaşık 2 x 2 mm) kesin.
   9. Hipokampal parçaları 1.8 ml önceden filtrelenmiş papain çözeltisi içeren bir şişeye aktarın. Daha sonra ara sıra hafifçe çalkalayarak 37 ºC'de inkübe edin. 15 dakika sonra 90 μl DNaz I çözeltisi (50 μg/ml final) ekleyin ve 15 dakika daha inkübe edin.
   10. Dokuyu 10 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve parçaları taze Nörobazal Kültür Ortamı ile yıkayın. Doku parçalarını 5 ml'lik plastik bir pipetten geçirerek hücre süspansiyonu elde edin.
   11. 5 dakika boyunca 160 x g'da santrifüj hücresi süspansiyonu. Plastik steril bir Pasteur pipeti kullanarak süpernatanı çıkarın ve peleti 1 ml otomatik pipetle 1 ml Nörobazal Kültür Ortamında dikkatlice askıya alın.
   12. Neubauer sayma odası kullanarak hücre yoğunluğunu ölçün. Cam lamel Neubauer haznesinin üzerine koyun. 10 μl hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre süspansiyonunun hazneye düzgün bir şekilde girdiğinden ve kabarcık oluşturmadığından emin olun. Mikroskop altında hücre sayısını sayın ve 30 x 10 açıklık içeren 40-80 μl'lik uygun bir damla elde etmek için karşılık gelen hesaplamaları yapın³ hücreler. Toplam hücre sayısı, kullanılan hayvan sayısına bağlı olacaktır.
3. Sıçan hipokampal nöronlarının kısa ve uzun vadeli kültürü.
   1. Daha önce hazırlanmış ve inkübatörde tutulan 500 μl Nörobazal Kültür Ortamı içeren dört kuyulu çok çanaklı plakanın üzerine, yaklaşık 30 x 10<span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 0.6em; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' >³ hücreleri, bir poli-D-lizin kaplı, 12 mm çapında cam lamel içeren çok çanaklı plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 50 μl'lik bir damla halinde yerleştirin.
   2. Birincil hipokampal hücreleri nemlendirilmiş 37 ºC ve %5 CO₂2-5 gün boyunca inkübatör in vitro (DIV, kısa süreli, genç kültürler) veya >15 DIV (Uzun dönemli, yaşlı kültürler) denemelerinden önce kültür ortamını değiştirmeden çalışır.

2. Sitozolik Ca'nın Floresan Görüntülemesi²⁺ Konsantrasyon

1. Floresan görüntüleme için test çözeltilerinin hazırlanması.
   1. mM cinsinden aşağıdakileri içeren harici bir HEPES tamponlu salin (HBS) çözeltisi hazırlayın: NaCl 145, KCl 5, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, glukoz 10, sodyum-HEPES 10 (pH 7.42).
   2. Prepare an external, Mg²⁺ içermeyen, HEPES tamponlu tuzlu su (HBS) solüsyonu içeren, mM cinsinden: NaCl 146, KCl 5, CaCl₂ 1, glukoz 10 ve HEPES 10 (pH 7.42).
   3. Mg<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺ içermeyen, HEPES tamponlu salin (HBS) ve bunu 10 μM glisin ile destekleyin.
   4. (mM cinsinden) çözerek NaCl yerine KCl içeren bir HBS çözeltisi hazırlayın: KCl 145, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, glukoz 10 ve HEPES 10 (pH 7.42).
2. Hipokampal hücrelerin floresan kalsiyum probu fura2 / AM ile yüklenmesi.
   1. lamelleri içeren lamelleri içeren hücre kültürünü inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) HBS besiyeri ile oyuk başına 500 μl HBS içeren yeni bir dört kuyulu çok çanak plakaya aktararak yıkayın.
   2. Hücreleri fura2 / AM 4 μM (aynı HBS ortamında hazırlanmış) ile karanlık bir yerde RT'de (25 ºC) 60 dakika inkübe edin.
   3. 60 dakika sonra lamelleri taze HBS besiyeri ile yıkayın.
3. Sitozolik [Ca²⁺] kültürlenmiş hücrelerde.
   1. Lambayı, mikroskobu, perfüzyon sistemini, floresan kamerayı ve bilgisayarı açın.
   2. Lamelleri, ters çevrilmiş mikroskop tablasında açık 12 mm cam lameller için termostatlı bir platforma yerleştirin ve 40X objektif (yağ, sayısal açıklık [NA]:1.3) kullanarak mikroskobik bir alan seçin. Test maddelerinin yokluğunda veya varlığında hücreleri önceden ısıtılmış (37 ºC) HBS ortamı ile sürekli olarak perfüze edin. Akışı yaklaşık 5-10 ml / dak hızında tutun.
      Note: Canlı hücreler için hücre perfüzyon sistemi, açık 12 mm cam lameller için termostatlı bir platforma monte edilmiştir. Çözeltileri perfüze etmek için bir valf kontrolörü ile donatılmış 8 hatlı yerçekimi tahrikli perfüzyon sistemi kullanılır. Fazla ortamın giderilmesinden bir vakum pompası sorumludur. Çözeltiler, tüp içi bir ısıtma sistemi kullanılarak ısıtılır.
   3. Her iki uyarma dalga boyunda deklanşör kapalıyken bir arka plan görüntüsü yakalayın.
   4. Epi-hücreleri dönüşümlü olarak 340 ve 380 nm'de aydınlatır. Fura-2 dikroik ayna tarafından filtrelenen bir floresan kamera ile her 5-10 saniyede bir 520 nm'de yayılan ışığı kaydedin.
   5. Kayıt süresi bittiğinde, daha fazla analiz için 520 nm'de yayılan görüntülerin tam dizisini bilgisayarda saklayın.
4. Kaydedilen floresan görüntülerin analizi.
   1. Deneme dosyasını açın. Aquacosmos yazılımını kullanarak 'Oran'a tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin. Bir dizi oran görüntüsü elde etmek için elde edilen görüntülerdeki piksel piksel oranını hesaplayın.
   2. 'Arka plan elemesini' ayarlayarak arka planı çıkarın. 'Hesaplamayı başlat'a basın.
   3. 'Tüm zamanlar sırası' düğmesine basın ve eski ilgi alanlarını (ROI'ler) silin. Tek tek hücrelerin kantitatif analizi için, tek tek nöronlara karşılık gelen yeni ilgi bölgeleri veya ROI'ler oluşturun. Tek tek ROI'ler (hücreler) için oran floresan değerlerinin bir kaydını elde etmek için her bir ROI'ye ve her görüntüye karşılık gelen her pikseldeki tüm oran değerlerinin ortalamasını alın.
   4. Tek tek kayıtların grafiğini çıkarmak için, her bir ROI'ye karşılık gelen oran floresan değerlerini bir grafik programına aktarın.
   5. Uygun bir veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak her bir stimülasyona yanıt olarak floresan oranındaki artışların boyutunu tahmin etmek için ilgili hesaplamaları yapın.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Neurobazal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (sığır pankreasından)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamin	Gibco	25030-032
12 mm cam lameller	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petri kapları	JD Catalan s.l.	2120044T
Steril pipetler	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microskobu	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER floresan kamerası	Hamamatsu
VC-8 valf kontrolörü	Warner Instruments
SH-27B ısıtma system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics