Beyin Dokusu Kesitlerindeki Amiloid-Beta Plaklarının İmmünolojik Etiketleme ve Kurkumin Boyama ile Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: }Maiti, P. et. al.,. Doğal Polifenol Kurkumin Kullanılarak Beyin Dokusundaki Amiloid Plaklarının Etiketlenmesi ve Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

{{}}Bu video, immünoetiketleme ve kurkumin boyama kullanılarak beyin dokusu kesitlerindeki amiloid-beta plaklarının görüntüleme prosedürünü göstermektedir. İmmünolojik etiketleme, amiloid-beta için özgüllük sağlarken, kurkumin, β yaprak açısından zengin fibrilleri seçici olarak bağlayarak görselleştirmeyi geliştirir. Kırmızı ve yeşil floresanın birlikte lokalizasyonu plakların varlığını doğrular.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

{{TAG_ 16}}1. Hayvanların perfüzyonu

1. Fiksatif ve perfüzyon tamponlarını hazırlayın.
   1. 80 g sodyum klorür (NaCl), 2 g potasyum klorür (KCl), 21.7 g disodyum hidrojen fosfat (Na₂₄·7H₂O), 2.59 g potasyum dihidrojen fosfat (KH₂PO₄) ve toplam 1 L yapmak için çift damıtılmış su.
   2. %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
      1. 1 L fosfat tamponlu saline (PBS) 40 g paraformaldehit ekleyin (0.1 M, pH 7.4).
      2. PFA çözeltisini 60−65 °C'ye ısıtın ve manyetik bir karıştırıcı kullanarak karıştırın.
         NOT: Sıcaklık 65 °C'yi geçmemelidir.
      3. {{}} Bir damlalık ile birkaç damla sodyum hidroksit (NaOH) (1 N) ekleyin.
      4. PFA çözeltisini orta ila ince filtre kağıdı ile filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
         NOT: Çözelti bir ay boyunca iyidir.
2. Hayvan anestezisi ve perfüzyonu gerçekleştirin.
   NOT: On iki aylık B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x ailesel Alzheimer hastalığı (5×FAD)) yaş uyumlu kontrol fareleri (grup başına n = 6) satıcılardan satın alındı ve Saginaw Valley Eyalet Üniversitesi'nin hayvan evinde yetiştirildi. Genotipleme polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile doğrulandı. İnsan Alzheimer hastalığı (AD) beyin dokusu, ölüm sonrası AD beyin dokusunu ve yaşa uygun kontrol dokusunu içerir.
   1. Hayvanı, sodyum pentobarbital (390 mg / kg vücut ağırlığı) veya bir ketamin / ksilazin karışımı (80 mg / kg vücut ağırlığına kadar ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığına kadar ksilazin) gibi uygun bir anestezik madde ile intraperitoneal enjeksiyon (27 G iğne ve 1 mL şırınga) ile uyuşturun. Bir ayak parmağını sıkıştırarak anestezi seviyesini kontrol edin. Hayvan yanıt vermiyorsa, perfüzyon ameliyatı için hazırdır.
   2. Anestezi uygulanmış hayvanı perfüzyon cerrahisi tepsisine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve küçük iris makası kullanarak sol ventrikülün arka ucuna bir kesi yapın.
   3. Sol ventriküle 22 G'lik bir perfüzyon iğnesi yerleştirin ve perfüzyon sıvısını vücuttan çıkarmak için sağ kulak kepçesinde küçük bir kesi yapın. Buz gibi soğuk perfüzyon sıvısının (0.1 M PBS, pH 7.4) 5-6 dakika (akış hızı 20−25 ml / dak) akmasına izin vermek için yerçekimi beslemeli bir perfüzyon sistemi kullanın.
      NOT: Berrak bir karaciğer optimum perfüzyonun göstergesidir.
   4. Tampon valfini sabitlemek için buz gibi soğuk %4'lük bir paraformaldehit çözeltisine geçirin ve 8-10 dakika akmasına izin verin.
      NOT: Titreme ve ardından sertleşmiş veya sert uzuvlar iyi bir fiksasyonun göstergesidir.
   5. Makas kullanarak beyni kafatasından çıkarın. Bir spatula kullanarak beyni toplayın ve %4 PFA (beynin hacminin en az 10 katı) içeren bir şişeye koyun ve daha fazla kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.

2. Doku işleme

1. Kriyostat bölümlerini kesin.
   1. Beyni kademeli sükroz çözeltilerine (%10, %20 ve %30) aktarın ve kullanılana kadar her biri 24 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
   2. -22 °C'de bir kriyostat kullanarak 40 μm kalınlığında bölümler kesin. PBS ve sodyum azid (% 0.02) ile doldurulmuş 6 oyuklu bir plakada kuyu başına 10-20 bölüm toplayın.

3. cur(curcumin) Aβ plakları ve oligomerlerindeki Aβ antikoru ile birlikte yerelleştirin.

1. Adım 2.1.2'deki kriyostat bölümlerini 12 oyuklu bir plakada PBS 3x ile yıkayın.
2. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.5 Triton-X-100 ile PBS içinde çözülmüş %10 normal keçi serumu (NGS) ile bölümleri bloke edin.
3. Engelleme solüsyonunu atın. Bölümleri, 150 rpm'de bir çalkalayıcıda gece boyunca %10 NGS ve %0.5 Triton-X100 içeren taze bloke edici solüsyon içinde çözülmüş amiloid-beta (Aβ) spesifik antikorlarla (6E10 veya A11, 1:200 seyreltilmiş) inkübe edin.
4. Antikor solüsyonunu atın ve bölümleri PBS 3x ile her biri 10 dakika boyunca yıkayın.
5. İkincil antikor etiketi ile kırmızı florofor (örneğin, Alexa
6. 594) ile karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
7. PBS 3x ile her birini 10 dakika yıkayın.
8. % 70 alkol 1x ile yıkayın.
9. Bölümleri kurkumin (Cur (10 μM)) ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
10. %70 alkol ile 3x 1 dakika yıkayın.
11. %90 ve %100 alkolle 1 dakika dehidre edin, her biri 5 dakika boyunca ksilen 2x ile temizleyin ve {{}} distiren plastikleştirici ksilen (DPX).
12. Kırmızı ve yeşil sinyaller için uygun uyarma/emisyon filtrelerine sahip bir floresan mikroskobu kullanarak görselleştirin.

Malzemeler