İki Fotonlu Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Bir Farede Protein Kinaz A Aktivitesinin Görselleştirilmesi

Abstract

Kaynak: Jongbloets, B. C., {{}} et al. Protein Kinaz A'nın Görselleştirilmesi: İn Vivo İki Fotonlu Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanılarak Başa Sabit Davranan Farelerde Aktivite. (2019)

Bu video, zorlanmış hareket sırasında kafası sabit, davranan farelerde protein kinaz A aktivitesini görselleştirmek için iki fotonlu floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu prosedürünü göstermektedir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirildi.

1. In Vivo İki Fotonlu Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu

1. Kraniyal pencerenin kurulumundan 2 hafta sonra veya sonrasında iki fotonlu floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (2pFLIM) görüntülemeye başlayın. Fareyi alıştırmak için görüntüleme çalışmasının başlamasından önce fareyi sık sık tutarak ve tırmalayarak stresten kaynaklanan deneysel paraziti en aza indirin.
2. İki fotonlu lazeri kontrol eden yazılımı kullanarak iki fotonlu uyarma lazer dalga boyunu 960 nm'ye ayarlayın.
3. % 4 izofluran kullanarak fareyi uyuşturun. Kuyruk kıstırma ve solunum hızlarını gözlemleyerek uygun anesteziyi onaylayın. Yani, kuyruk kıstırmasına yanıt verilmemeli ve solunum hızı saniyede ~ 1 nefese düşürülmelidir. Gereksiz işlem süresini en aza indirmek ve anestezi sadece iki ila üç dakika sürdüğü için göz kayganlaştırıcılar kullanılmaz.
4. Anestezi uygulanmış fareyi motorlu koşu bandına aktarın (Figure 1C) ve farenin kafa plakasını koşu bandı kurulumunun başlık plakası tutucusuna monte edin (bkz. Figure 1 detaylar için). Fare üzerindeki kraniyal pencere örtüsünün yüzeyini %70 etanol ile temizleyin.
5. Motorlu koşu bandını monte edilmiş fare ile 2pFLIM objektifinin altına yerleştirin. Kraniyal pencere lamolası ile objektif arasına bir damla damıtılmış su uygulayın.
6. Monte edilmiş farenin anesteziden uyanmasına ve en az 10 dakika boyunca koşu bandı ve mikroskop ortamına alışmasına izin verin. Takılı fare anesteziden uyanırken farenin solunum hızını izleyin.
7. Epi-aydınlatma altındaki enjeksiyon konumuna gidin. Sonraki görüntüleme oturumları sırasında aynı ilgi alanının (ROI) görüntülenmesine yardımcı olmak için parlak alan altında referans özelliklerini (yani kan damarları) belgeleyin.
8. Beyin dokusundan yayılan ışık dışında gelen ışığı ortadan kaldırın. Epi-aydınlatma ışık kaynağını kapatın ve 2pFLIM teçhizatının muhafazasını kapatın. Donanım komut voltajı kontrolünü açarak 2pFLIM PMT'yi etkinleştirin.
9. Uyanık farelerde tAKARα-pozitif somata'yı görüntülemek için aşağıdaki önerilen ayarlarla 2pFLIM edinme yazılımı FLIMimage'ı kullanarak bir z-stack 2pFLIM görüntüsü elde edin. Kare ortalamasını 3 kareye, tarama hızını 2 ms/satıra, görüntü boyutunu 128 x 128 piksele ve görüş alanını 90−100 μm'ye ayarlayın. Görüntüleme ayarlarını hazırlık ve donanım yapılandırmasına göre ayarlayın.
10. Alınan görüntüyü FLIM görünümünde inceleyin (şirket içinde geliştirilen özel yazılım). Foton sayısını optimize etmek ve foto ağartmayı en aza indirmek için adım 1.9'u izleyerek görüntüleme ayarlarını yapın.

NOT: Bir tAKARα-pozitif soma'nın in vivo ömür boyu görüntülenmesi için bir ROI'de uygulanabilir bir entegre foton sayısı, belirli bir uyarandan kaynaklanan sinyal genliğine bağlı olarak ~1.000−10.000 fotondur.

1. Entegre foton sayımlarını artırmak ve yaşam süresi tahmin hatasını azaltmak için azaltılmış görüş alanı, azaltılmış tarama hızı, artan lazer gücü ve ortalaması alınacak kare sayısını artırın. Aynı zamanda, foto ağartmayı en aza indirmek için minimum gerekli lazer gücünü, kare ortalamasını ve tarama hızını kullandığınızdan emin olun.
2. Adım 1.10'da belirlenen ayarları kullanarak z-yığını alımını tekrarlayarak düzenli bir zaman aralığında (örn. her 30−60 saniyede bir) görüntü. Sıfır koşu bandı hızında en az 15 dakika boyunca temel 2pFLIM görüntüleri elde edin.
3. 2pFLIM görüntüleri alırken koşu bandı dönüş hızını 15 dakika boyunca ~15 cm/s'ye ayarlayın. Zorlanmış hareketin kesilmesinden sonra PKA aktivitesinin süresini değerlendirmek için koşu bandı rotasyonunu kapattıktan sonra ≥20 dakika boyunca görüntülemeye devam edin.
   <

p style='line-height:1.799999999999998;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>2. 2pFLIM Görüntülerinin Analizi

1. Alınan görüntüleri FLIMview'da açın ve FLIMview'da aşağıdaki parametreleri ayarlayın.

1. FLIMview'da tek foton sayma (SPC) minimum ve maksimum aralık alanlarına tıklayın. Tipik olarak sırasıyla 1.2−2 ile 10−12 ns arasında değişen uygun minimum ve maksimum SPC aralığı değerini girin.

2.₀ değer alanı FLIMview'da ve t₀ değeri (tipik olarak ~2 ns). FLIMview'da ömür boyu parlaklık minimum eşik değeri alanına tıklayın ve istenen eşik değerini 5−30 fotona girin.

2. Yeni grup düğmesine tıklayın (N) ve bir deneme grubu adı atayın. Bu, eklenen her FLIM görüntüsündeki verileri birleştiren bir grup oluşturur.

3. ROI Roi Controls ve tAKARα pozitif soma etrafında bir ROI çizin. z-stack Control.

4. FLIM görüntüsünü gruba eklemek için + düğmesine tıklayın (adım 2.2). Calc düğme.

5. Kronolojik 2pFLIM görüntüleme serisindeki bir sonraki dosyayı açın. Adım 2.4'ü tekrarlayın. Zaman içinde aynı tAKARα pozitif soma'yı ölçmek için ROI ve z-stack aralığının konumunu ayarladığınızdan emin olun, çünkü zaman içinde doku kayması olabilir.

6. deltaMPET/MPET₀açılır menüsünde <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Grup Denetimleri modülü. baseline# alanına tıklayın ve dizinleri girin (örn. 1 2 3 4 5 adım 2.3'te oluşturulan gruptaki ilk beş görüntü için geçerlidir). Bu, taban çizgisi ömrünü hesaplamak için kullanılan görüntüleri tanımlar (LT₀).

7. Plot üzerine tıklayarak FLIM yanıtını (ΔLT/LT₀) tanımlanan ROI'lerde deney sırasında tAKARα'nın. Karşılık gelen temel yaşam süresine göre tek tek ROI'lerin yaşam süresindeki (ΔLT) normalleştirilmiş değişiklikler (LT₀) farklı ROI'ler arasında hareket sırasında PKA aktivitesinin karşılaştırılmasına izin verir.

Results

Materials