Fare Beyin Dokusunda Kuduz Virüsü Enfeksiyonunun Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Zaeck, L., et al. Solventten Arındırılmış Beyin Dokusunda Kuduz Virüsü Enfeksiyonunun Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, enfeksiyon ilerlemesini değerlendirmek için kuduz virüsü (RABV) ile enfekte olmuş fare beyin dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesi sürecini göstermektedir. Floresan işaretleyicilerle doku boyama, dehidrasyon, temizleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu için montaj dahil olmak üzere üç boyutlu bir temsilin oluşturulmasıyla sonuçlanan temel adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

RABV ile enfekte, paraformaldehit (PFA) ile sabitlenmiş arşivlenmiş beyin materyali kullanıldı.

DİKKAT: Bu protokol çeşitli toksik ve/veya zararlı maddeler kullanır, PFA, metanol (MeOH), hidrojen peroksit (H₂O₂), sodyum azid (NaN₃), tert-butanol (TBA), benzil alkol (BA), benzil benzoat (BB) ve difenil eter (DPE). MeOH ve TBA son derece yanıcıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) giyerek ve çeker ocakta deneyler yaparak maruziyetten kaçının. Atıkları uygun kaplarda ayrı olarak toplayın ve yerel yönetmeliklere göre atın. Kuduz virüsü, biyogüvenlik seviyesi (BSL)-2 patojeni olarak sınıflandırılır ve bu nedenle genellikle BSL-2 koşulları altında ele alınabilir. Aerosol üretebilen, yüksek virüs konsantrasyonlarıyla çalışabilen veya yeni lizavirüslerle çalışabilen prosedürler dahil olmak üzere bazı aktiviteler BSL-3 sınıflandırması gerektirebilir. Hayvan bakıcıları ve laboratuvar çalışanları da dahil olmak üzere yüksek riskli personel için maruziyet öncesi profilaksi önerilir. Yerel yönetim düzenlemelerine bakın.

1. Beyin dokusunun sabitlenmesi ve kesitlenmesi

1. {{}}Beyin örneklerini fosfat tamponlu salin (PBS [pH 7.4]) içinde fosfat tamponlu salin (PBS [pH 7.4]) içinde en az 48 saat boyunca 4 ° C'de (yaklaşık doku-fiksatif oranı 1:10 [v / v] ile) uygun bir hacimde% 4 PFA'ya sabitleyin.
2. Doku örneklerini her yıkamada en az 30 dakika boyunca PBS'de 3 kez yıkayın ve kullanana kadar %0,02 NaN₃/PBS'de saklayın.
3. Dokuyu bir vibratom kullanarak 1 mm kalınlığında bölümlere ayırın (bıçak besleme hızı: 0,3–0,5 mm/sn, genlik: 1 mm, dilim kalınlığı: 1.000 μm).
4. Doğru dilim sırasını korumak için, her doku bölümünü ayrı ayrı çok kuyulu bir hücre kültürü plakasının bir kuyusunda saklayın. % 0.02 NaN₃/PBS ekleyin ve doku kesitlerini kullanana kadar 4 °C'de saklayın.

2. Metanol ile numune ön işlemi

NOT: Tüm inkübasyon adımlarını hafif salınımla ve aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirin. Numuneleri ışıktan koruyun. Numune ön işlemi, sırasıyla MeOH ve H₂₂.

1. Damıtılmış suda %20 (h/h), %40, %60 ve %80 MeOH çözeltileri hazırlayın. Örneğin, %20 MeOH için, uygun bir sızdırmaz kapta 40 mL damıtılmış suya 10 mL %100 MeOH ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.
2. Numuneleri makul büyüklükteki kaplara aktarın (örneğin, 5 mL reaksiyon tüpleri). Bu protokolde kullanılan reaktiflere kimyasal olarak dayanıklı malzemeler kullanmaya özen gösterin. Örneğin, polipropilen uygun olsa da polistirenin uygun olmadığını unutmayın.
   NOT: Bu protokoldeki hacim özellikleri 5 mL reaksiyon tüplerine atıfta bulunur. Farklı bir kap kullanılıyorsa, hacimleri buna göre ayarlayın.
3. Numuneleri, hazırlanan MeOH çözeltileri serisinin her bir konsantrasyonunun 4 mL'sinde, her biri 1 saat boyunca artan sırayla inkübe edin.
4. Numuneleri her biri 1 saat boyunca 2 kez saf (% 100) MeOH içinde inkübe edin.
5. Numuneleri 4°C'ye soğutun (örn. laboratuvarda güvenli bir buzdolabında).
6. Örneğin, %30 H₂O₂{{}}) örneğin, %30 H₂O₂ stok çözeltisini 1:6 inç saf (%100) MeOH ve 4 °C'de soğutun.
7. {{}} soğutulmuş numunelerden %100 MeOH'yi çıkarın ve 4 mL önceden soğutulmuş ağartma solüsyonu (%5 H₂O₂) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
8. Ağartma solüsyonunu 4 mL %80 MeOH ile değiştirin ve 1 saat inkübe edin. Hazırlanan MeOH çözeltileri serisini, numuneler 4 mL'de% 20 MeOH'de 1 saat inkübe edilene kadar her biri 1 saat boyunca azalan sırada kullanmaya devam edin.
9. Numuneleri 1 mL PBS ile 1 saat boyunca 4 kez yıkayın.

3. İmmün boyama

NOT: Tüm inkübasyon adımlarını hafif salınımla ve aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirin. Numuneleri ışıktan koruyun. Mikrobiyal büyümeyi önlemek için, bu bölümdeki çözeltilere %0,02'lik bir nihai konsantrasyona NaN₃ ekleyin. Doku örnekleri, noniyonik deterjanlar Triton X-100 ve Tween 20 ile muamele edilerek daha da geçirgenleştirilir. Normal serum, spesifik olmayan antikor bağlanmasını bloke etmek için kullanılır. İmmünoketiketleme arka planını azaltmak için glisin ve heparin eklenir.

1. Numuneleri 2 kez 1 saat boyunca 4 mL% 0.2 Triton X-100 / PBS içinde yıkayın.
2. Numuneleri 37 ° C'de 2 gün boyunca 4 mL %0.2 Triton X-100/20% dimetil sülfoksit (DMSO) / 0.3 M glisin / PBS ile geçirgenleştirin.
3. Numuneleri 2 gün boyunca 37 ° C'de 4 mL% 0.2 Triton X-100 /% 10 DMSO /% 6 normal serum / PBS içinde inkübe ederek antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke edin.
   NOT: İdeal bloke etme sonuçları elde etmek için ikincil antikorun yükseltildiği aynı türden normal serum kullanın.
4. Numuneleri 37 ° C'de 5 gün boyunca 2 mL birincil antikor çözeltisi (% 3 normal serum ve% 5 DMSO / PTwH [heparinli PBS-Tween 20] + birincil antikor / antikorlar) içinde inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini 2.5 gün sonra yenileyin.
   1. PTwH için, 10 mg / mL'lik bir stok çözeltisi yapmak için heparin sodyum tuzunu damıtılmış suda yeniden sulandırın (bu çözeltiyi 4 ° C'de saklayın). Stok çözeltisini %0.2 Tween 20 / PBS'ye 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
      NOT: Doğru antikor seyreltmesinin seçilmesi optimizasyon gerektirebilir. Genel olarak, standart immünohistokimya konsantrasyonları iyi bir başlangıç noktasıdır.
5. Numuneleri 1 gün boyunca 4 mL PTwH'de yıkayın, yıkama tamponunu gün içinde en az 4x-5x değiştirin ve son yıkamayı gece boyunca açık bırakın.
6. Numuneleri 37 ° C'de 5 gün boyunca 2 mL ikincil antikor çözeltisi (% 3 normal serum / PTwH + ikincil antikor / antikorlar) içinde inkübe edin. İkincil antikor çözeltisini 2.5 gün sonra yenileyin.
   1. İkincil antikoru / antikorları ikincil antikor çözeltisinde 1:500'de seyreltin (ör., 2 mL'de 4 μL).
7. Numuneleri adım 3.5'te açıklandığı gibi 1 gün boyunca yıkayın ve son yıkamayı gece boyunca bırakın.

4. Nükleer boyama

NOT: Tüm inkübasyon adımlarını hafif salınımla ve aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirin. Numuneleri ışıktan koruyun. Başka bir floroforun uyarılması veya tespiti için nükleer boyama gerekmiyorsa veya tiyazol Kırmızısının (TO-PRO-3) uyarma dalga boyu/emisyon spektrumu gerekiyorsa, bu adımı atlayın.

1. Nükleik asit boyası TO-PRO-3'ü PTwH'de 1: 1.000'de seyreltin ve numuneleri 4 mL nükleer boyama solüsyonunda 5 saat inkübe edin.
2. Numuneleri adım 3.5'te açıklandığı gibi 1 gün boyunca yıkayın ve son yıkamayı gece boyunca bırakın.
   NOT: Yıkamaları takiben numuneler, optik temizleme yapılana kadar PBS'de 4 °C'de saklanabilir.

5. Doku temizleme

NOT: Tüm inkübasyon adımlarını hafif salınımla ve aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirin. Numuneleri ışıktan koruyun. Doku örnekleri, kademeli bir dizi TBA çözeltisinde kurutulur. İmmün boyama sulu çözeltiler gerektirdiğinden, tüm boyama prosedürleri doku temizlemeden önce bitirilmelidir. Optik boşluk ve kırılma indisi eşleşmesi, BA, BB ve DPE karışımı ile muamele edilerek elde edilir. Temizleme çözeltisi, bir antioksidan olarak DL-α-tokoferol ile desteklenir.

1. Damıtılmış suda %30 (h/h), %50, %70, %80, %90 ve %96 TBA çözeltileri hazırlayın. Örneğin, %30 TBA için, uygun bir sızdırmaz kapta 35 mL damıtılmış suya 15 mL %100 TBA ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.
   NOT: TBA'nın erime noktası 25–26 °C'dir; bu nedenle, oda sıcaklığında katı olma eğilimindedir. TBA çözeltilerini hazırlamak için, iyi kapatılmış şişeyi bir inkübatörde veya su banyosunda 37 °C'de ısıtın.
2. Numuneleri, hazırlanan TBA çözeltileri serisinin her bir konsantrasyonundan 4 mL ile her biri 2 saat boyunca artan sırayla dehidre edin. %96 TBA'yı bir gecede bırakın.
3. Numuneleri 2 saat boyunca saf (%100) TBA'da daha fazla kurutun.
4. Temizleme solüsyonu BABB-D15'i hazırlayın.
   NOT: BABB-D15, x:1 oranında DPE ile karıştırılan BA ve BB'nin (BABB) bir kombinasyonudur, burada x}, Bu durumda 15.
   1. BABB için, bir kısım BA'yı iki kısım BB ile karıştırın.
   2. BABB ve DPE'yi 15:1 oranında karıştırın.
   3. Hacimce %0.4 DL-α-tokoferol (E vitamini) ekleyin.
      NOT: Örneğin, 20 mL BABB-D15 için 6.25 mL BA ile 12.5 mL BB'yi karıştırın. 1.25 mL DPE ekleyin ve 0.08 mL DL-α-tokoferol ile destekleyin.
5. Numuneleri optik olarak şeffaf olana kadar (2-6 saat) temizleme solüsyonunda temizleyin.
6. Numuneler 4 °C'de BABB-D15'te, ışıktan korunarak, montaj ve görüntülemeye kadar saklanabilir.

6. Numune montajı

1. Bir 3D yazıcı kullanarak görüntüleme haznesini ve kapağı yazdırın (malzeme: kopolyester [CPE], nozul: 0,25 mm, katman yüksekliği: 0,06 mm, duvar kalınlığı: 0,88 mm, duvar sayısı: 4, dolgu: %100, destek yapısı yok).
2. Görüntüleme odasını birleştirin (Şekil 1).
   1. RTV-1 (tek bileşenli oda sıcaklığında vulkanizasyon) silikon kauçuk ile görüntüleme odasına yuvarlak bir lamel (çap: 30 mm) monte edin. Fazla silikon kauçuğu suyla ıslatılmış bir pamuklu çubukla çıkarın ve gece boyunca sertleştirin.
   2. RTV-22 silikon kauçuk ile kapağa yuvarlak bir lamel (çap: 1 mm) monte edin. Fazla silikon kauçuğu suyla ıslatılmış bir pamuklu çubukla çıkarın ve gece boyunca sertleştirin.
3. Numuneyi bir görüntüleme odasına yerleştirin, küçük bir hacimde BABB-D15 ekleyin ve kapağı yerleştirin. Hipodermik bir iğne (27 G x 3/4 inç [0,40 mm x 20 mm]) kullanarak hazneyi girişten BABB-D15 ile doldurun.
4. Girişi takın ve görüntüleme odasını RTV-1 silikon kauçukla kapatın. Karanlıkta gece boyunca kürleyin.

7. Görüntüleme ve görüntü işleme

{{TAG_534 TAG_535}}Kullanılan floroforlarla eşleşen ilgili lazer çizgilerini seçerek görüntü alımını ayarlayın. Kanallar arasında sinyal çakışmasını önlemek için her dedektörün algılama aralıklarını ayarlayın.
NOT: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 ve TO-PRO-3 için örnek algılama aralıkları sırasıyla 500–550 nm, 590–620 nm ve 645–700 nm'dir.

Alım parametrelerini seçin, z yığınının üst ve alt kenarlığını tanımlayın ve görüntü yığınını alın.
NOT: Örnek edinme parametreleri, 60-90 nm piksel boyutu, 0,5 μm z adım boyutu, satır ortalaması 1, tarama hızı 400 Hz ve iğne deliği boyutu 1 Airy birimidir.

3D projeksiyonlar oluşturmak veya derinlemesine analizler yapmak için uygun görüntü analiz yazılımını (örneğin, Fiji) kullanarak görüntü yığınını işleyin.
NOT: Alınan görüntü dosyalarının büyük boyutu nedeniyle, genellikle bir iş istasyonu kullanımı gereklidir.

1. Edinme veya görüntü dosyalarını Fiji'de açın (Dosya |{ {TAG_589}} Açık | Dosyaları seçin).
   1. Örneğin, LIF dosyaları kullanılıyorsa, Biyo-Biçimler iletişim penceresinde istediğiniz seçenekleri belirleyin veya seçimini kaldırın. Hyperstack ile yığını görüntüleyin. Bunun dışında, belirli bir seçim veya onay işareti gerekli değildir. OK tuşuna basın.
   2. Dosya birden fazla görüntü yığını içeriyorsa, analiz edilecek olanları seçin ve OK tuşlarına basarak onaylayın.
2. Birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölerek ağartma düzeltmesi yapın (Image |{ {TAG_645}} Renk | Kanallar Aracı, ardından Daha fazla | Kanalları Böl). Her kanal için ağartma düzeltmesini seçin (Image | Adjust | ) ve Basit Oran (arka plan yoğunluğu: 0.0).
   NOT: Bazı durumlarda, örneğin, sinyalde doğrusal bir bozulma olmadığında veya sinyal genel olarak çok zayıf olduğunda, Basit Oran başarısız olabilir. Alternatif olarak, Üstel Sığdırma deneyin veya ağartıcı düzeltmesini atlayın.
3. Kaydırıcıları kullanarak her kanal için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (Image |{ {TAG_724}} Ayarla | Parlaklık | Kontrast).
4. Kanalları birleştir (Image |{ {TAG_754}} Renk | Kanalları Birleştir), bileşik yapın (Görüntü | Renk | , sonra seçin Daha fazla | Kompozit Yap) ve RGB formatına dönüştürün (Image | Color | Kanallar Tool, ardından Daha fazla | RGB).
5. Gerekirse, hesaplama süresini ve dosya boyutunu azaltmak için görüntü yığınını yeniden boyutlandırın (Image | Adjust | Boyut, her iki seçenek de işaretlendi artı çift doğrusal enterpolasyon).
6. 3D projeksiyon oluşturma (Image | Yığınlar | 3D Project). Projeksiyon yöntemi olarak Brightest Point öğesini seçin ve dilim aralığını, alınan görüntü yığınının z adımlı boyutuyla eşleşecek şekilde ayarlayın. Maksimum kalite için dönüş açısı artışını 1 olarak ayarlayın ve enterpolasyonu etkinleştirin. Toplam dönüşü, saydamlık eşiklerini ve opaklığı gerektiği gibi değiştirin.
7. Gerekirse, 3D projeksiyonu tekrar 8 bit formatına (Image | {{}}| 8-bit). İlgili kaydırıcıları kullanın (Image | Adjust | Brightness | Contrast) ve görüntü yığınını adım 7.3.4'te açıklandığı gibi RGB formatına dönüştürün.
8. 3D projeksiyonu farklı kaydedin. TIF dosyası (görüntü dosyası formatı) ve .AVI dosyası (video dosyası formatı).

Sonuçlar

Malzemeler