Sabit Bir Fare Beyin Diliminde Miyelinli Akson Çaplarını Belirlemek için Spektral Reflektometri Kullanma

Özet

Kaynak: Kwon, J., ve diğerleri. , Miyelinli Aksonlar Üzerinde Spektral Reflektometrik Mikroskopi In Situ . J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, girişim modellerini analiz etmek ve sabit beyin dokusu dilimlerinde miyelinli akson çaplarını belirlemek için hiperspektral konfokal mikroskop ile spektral reflektometrinin kullanımını göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Kalibrasyon

1. Lazer kaynağının termal stabilizasyonunu sağlamak için görüntülemeden en az 1 saat önce mikroskobu açın (bkz. Ardından, spektral tarama için yazılımı açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve GUI'nin (grafik kullanıcı arayüzü) üst kısmındaki Al düğmesine tıklayın (Şekil 1a).
2. Beyaz ışık lazeri (WLL) ve fotoçoğaltıcı tüp (PMT) için yazılım kapağını açın (Şekil 1a).
3. Edinme Modu'ndaki açılır listeden xyΛ modunu seçin, ardından lazer giriş modu otomatik olarak Sabit yüzde'den Sabit Güç'e değiştirilir. Otomatik SP Hareketi onay kutusunun işaretini kaldırın. Ardından, Λ-Uyarma Lambda Tarama Ayarlarında (Şekil 1b) giriş lazerinin spektral penceresini 470–670 nm'ye ayarlayın.
4. Spektral aralık için ayar çubuğunu çift tıklayarak veya hareket ettirerek PMT'nin spektral aralığını 450-690nm'ye AYARLAYIN (Şekil 1c).
   Not: Bu spektral aralık, giriş kaynağının tam bant genişliğini içermelidir.
5. Yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA > 0.7) uygun bir suya daldırma objektif lensi seçin ve AOBS'yi etkinleştirmek için PMT ve lazer gücüne herhangi bir değer verin (Acousto-optik ışın ayırıcı) yapılandırması ve Canlı Tarama düğmesi. AOBS Yapılandırmasındaki yansımayı kontrol ederek optik yolu değiştirin (Şekil 1d).
6. Mikroskop tablasına bir referans aynası (Malzeme Tablosuna bakın) monte edin. Ayna yüzeyi objektif merceğe bakmalıdır. Aynayı mikroskop tablasına monte etmek kolay değilse, bir aynayı düz bir plakaya bağlayın (, örneğin , sürgülü cam).
7. Odak düzlemini ayna yüzeyine hizalamak için mikroskop aşamasını kontrol edin.
8. Dedektörün dinamik aralığını göz önünde bulundurarak PMT kazancını ve lazer gücünü ayarlayın ve ardından lazer giriş modunu Sabit Yüzde'den Sabit Güç'e değiştirin.
   Not: Tipik olduğu gibi, 570 nm'de 500 (V) PMT kazancı ve %0,1'lik bir bağıl lazer gücü kullanılır.
9. Dalga boyu aralığı boyunca doygunluk olmadığını kontrol etmek için sahte renk modunda onaylayın. Doygunluk gözlenirse, lazer gücünü düşürün (Şekil 1a).
10. Lambda Scan alımını çalıştırın.
11. Aynayı sahneden çıkarın ve karanlık referansı elde etmek için aynı alımı örnek olmadan tekrarlayın (, yani , koyu ofset).
12. Verileri Çok Yığınlı TIF biçiminde kaydedin.

2. SpeRe (Spektral reflektometri)

1. Monte edilen dokuyu mikroskop tablasına yerleştirin. Dokuyu objektif merceğin odak düzlemine kabaca hizalamak için, bir göz merceği aracılığıyla geniş alanlı floresan modunu kullanın.
2. Canlı Tarama açıkken, odak düzlemini dokudaki ilgili bölgeye hizalamak için mikroskop aşamasını kontrol edin. Lamelden kaynaklanan arka plan gürültüsünü önlemek için, cam doku arayüzünden en az 15 μm derinlikte hedef bölgeyi seçin.
3. Adım 1.1–1.10'da açıklanan prosedürün aynısını kullanarak hedef bölge için spektral görüntü yığınını alın.
4. Doku ve koyu ofset verilerini Çok Yığınlı TIF biçiminde kaydedin.
   Not: Deneyci bu aşamada duraklayabilir.

3. Görüntü İşleme ve Analizi

1. {{}}Referans aynası ve beyin dokusu için spektral verileri (çok yığılmış TIF) ImageJ'de açın.
2. Açılan görüntü yığınları için ROI'leri (ilgi bölgeleri) seçin - referans aynası için merkezi alan ve beyin dokusu için bir akson lifinin segmenti.
3. Image → Stacks → ImageJ menüsünde Z ekseni profili grafiğini çalıştırarak seçilen ROI'ler için ham spektrumları elde edin.
4. Biri referans aynası için, diğeri beyin dokusu için alınan koyu ofset verilerini açın.
5. Image → Stacks → ImageJ menüsünde Z ekseni profili grafiğini çizin.
6. Kopyala ve Yapıştır seçeneklerini kullanarak elde edilen tüm spektrumları kaydedin.
   Not: SpeRe görüntüleme için, eksen dışı optik sapmaları en aza indirmek için merkezi görüntüleme alanının kullanılması önerilir. Akson lifleri, uzunlukları boyunca yapısal olarak heterojen olabilir. Bu nedenle, kısmi hacim artefaktını en aza indirmek için tipik olarak 5 μm< küçük bir akson segmentinde ROI'nin seçilmesi önerilir.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Apochromat objektif 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Suya daldırma tipi.
Floromyelin Yeşili	Thermo Fisher	F34651
{{}}Leica SP8 TCS mikroskobu	Leica Microsystems	SP8
Görüntüleme yazılımı	Leica Microsystems	LAS-X
Matlab	MathWorks
Ayna	Thorlabs	PF10-03-P01	Korumalı gümüş ile kaplanmıştır.
Kapak kayması	Thermo Fisher	3306	Kalınlık: #1 (0,13 ila 0,17 mm).
Sürgülü cam	Muto Saf Kimyasallar	5116-20F	Kalınlık: ~1 mm.
	Henkel	Loctite 406	Cilt veya göz temasını önlemek için bir dağıtım ekipmanı kullanın.
Beyaz ışık lazeri	NKT fotonik	EXB-6	EXB-6 durduruldu ve EXU-6 ile değiştirildi.

} {{TAG_ 48}}