Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Motor Nöron Projeksiyonlarının ve Akson Dallanmasının Görselleştirilmesi

Abstract

Source: Liau, E. S. et al. Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Embriyolarında Motor Akson Navigasyonunun Görselleştirilmesi ve Akson Arborizasyonunun Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, motor nöron projeksiyonlarını ve akson dallanmasını görüntülemek için ışık tabakası floresan mikroskobunun kullanımını göstermektedir. transgenik fare embriyoları. Motor nöron büyümesini ve bağlantısını değerlendirmek için numune hazırlama, görüntüleme ve aksonal dallanmanın 3D rekonstrüksiyonu ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protocol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler uygun hayvan etik tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. İnceleme Komitesi.
<

p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>1. Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) (2–3 saat)

1. Sample set-up
   1. 5X/0.1 aydınlatma optiği ve 5X/0.16 algılama optiği ayarlayın. Numune tutucuyu ve numune kılcalını (1,5 mm iç çap, yeşil) birleştirin ve mikroskoba yerleştirin.
      NOTE: Ayrıntılı kurulum prosedürleri için mikroskobun Kullanım Kılavuzuna bakın.
   2. Embriyoyu aşağıdaki gibi monte edin:
      1. P200 pipet ucunu, üst kısmı kılcal damarın çapına uyacak şekilde keserek hazırlayın ve numune eki için sivri kısmı (~ 3 mm) çıkarın.
      2. Pipet ucunun körelmiş ucunu küçük bir alev kullanarak eritin.
      3. Alevi söndürün ve embriyoyu erimiş uca dikey olarak hızlı bir şekilde tutturun.
      4. Pipet ucunun üst kısmını numune kılcal damarı ile takın.
   3. Kalıntıları veya kabarcıkları temizlemek için hazne tamponunun embriyo ile 1 dakika dengelenmesine izin verin.
   4. Görüntüleme yazılımını kullanarak select Locate capillary Locate sekmesine gidin ve örnek kılcal damarı konumlandırmak için x, y ve z eksenlerini ayarlayın.
   5. Select Locate sample ve embriyoya odaklanmak için 0,6X'e yakınlaştırın. Görüntülenen uzvun uzun ekseninin iki ışık kaynağının ışık yolu ile hizalandığından emin olmak için embriyoyu döndürün (Figure 1B).
2. Görüntü edinme
   1. Under the Edinme tab, algılama hedefleri, lazer engelleme filtresi, ışın ayırıcı, kameralar ve lazerler gibi ışık yolu parametrelerini tanımlayın.
      NOTE: Bu deneyde yeşil floresan protein (GFP) kanalı kullanılmıştır (Uyarma dalga boyu: 488 nm; emisyon filtresi: bant geçiren (BP) 505 ila 545 nm; ışın ayırıcı: SPS LP 560).
   2. Gölge azaltma için pivot tarama onay kutusunu işaretleyin.
   3. Edinme ayarlarını tanımlayın: bit derinliği, 16 bit; yakınlaştırma, 0.36-0.7X; Tek taraflı aydınlatma (sol/sağ) veya çift taraflı aydınlatma.
   4. Continuous ve daha keskin görüntüler elde etmek için lazer yoğunluğunu, pozlama süresini, lazer gücünü ve ışık tabakası konumunu ayarlayın.
      NOTE: Foto hasarı en aza indirmek için lazer gücü mümkün olduğunca düşük tutulur.
   5. Press STOP görüntü alımını sonlandırmak için.
3. Çok boyutlu edinim
   1. İlk ve son görüntü için Z konumunu hareket ettirerek z yığınını tanımlayın. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Optimal dilim numarasını ayarlamak için.
   2. Seçili z-yığınını almak için Start Experiment seçili z-yığınını almak için.
   3. Tamamlandığında, görüntüyü .czi formatında kaydedin.
4. Görüntü işleme (isteğe bağlı)
   1. Proceed with Çift taraflı füzyon under the Lightsheet Processing kanal. Multiview işleme birden çok açıdan görüntüleri birleştirmek için çoklu görünümler alınırsa gereklidir.
   2. altında projeksiyon ekseni boyunca en yüksek yoğunluklu piksellerden gelen verileri kullanarak bir 2D görüntü oluşturun <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu kanalı.
   3. <span stilinin altında='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Copy kanalı, Subset orijinal kümeden görüntü alt kümelerini seçmek için.

2. Akson Arborizasyonunun Ölçülmesi (Her Bir Sinir İçin 30 Dakika)

1. Görüntü dosyasını görüntüleme analiz yazılımında açın (varsayılan olarak, XYZ verilerini içeren görüntü Aşma modunda ve 3B olarak oluşturulmuş bir görünüm olarak açılır).
2. Display Adjustmentwindow (Edit | Ekran Ayarını Göster) yerel yoğunluk kontrastına dayalı filamentleri algılamak için.
3. Add New Filaments simgesini seçin ve Autopath (döngü yok) açılır menüdeki algoritma.
4. İlgilendiğiniz bölgeyi seçin (bu durumda, ilgilenilen segmentasyon aksonu). <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Next bittiğinde.
5. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Slice modu.
6. İlgilenilen bölgenin kenarına bir başlangıç noktası atayın. Başlangıç noktalarının el ile eklenmesini veya kaldırılmasını sağlamak için, önce işaretçi modunu değiştirin (Navigate | Select) ve then Shift + sağ tıklama.
7. Tüm görünür ağaç iptallerinin işaretlendiğinden emin olmak için tohum noktaları için manuel eşikleri seçin. İşaretçi modunu değiştirme (Navigate | Select) ve then Shift + sol tıklama.
   NOTE: Arka plandaki gürültüleri ve sinyalleri komşu sinirlerden manuel olarak kaldırmak önemlidir.
8. Kutuyu işaretleyin Başlangıç noktalarının etrafındaki çekirdek noktaları kaldır.
9. Kontrol Bağlantısız segmentleri kaldır Çok uzakta olan ve arka plan gürültüsünü temsil edebilecek noktaların hariç tutulmasına izin vermek için. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Maximum Gap Length için üst sınırı tanımlamak için sonraki adımda Dışlama.
10. Her vokselin arka plan yoğunluğunu tahmin etmek için bir Gauss filtresi kullanan arka plan çıkarma eşiğini ayarlayın.
11. Approximate-section-area kullanarak dendrit çapı için otomatik eşiği ayarlayın algoritması.
12. Omurga hesaplama adımlarını atlayın.
13. İşlemi tamamlayın ve istediğiniz stili ve rengi seçin.
14. Properties yalnızca yeniden yapılandırılmış aksonları görüntülemek için.
15. <span stili='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Statistics tab, select Detailed. Use Filament No. Dendrite Terminal Points.
    NOTE: İstatistiksel İstenirse ek açıklama eklenebilir.
16. Yeniden yapılandırılmış aksonun görüntüsünü bir .tif dosyası olarak dışa aktarın.

Results

Materials