Düzleştirilmiş Beyin Kesitlerindeki Kortikal Modüllerin Histokimyasal Görüntülenmesi

Özet

Source: Lauer, S. M., et al. Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortexes. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, histokimyasal boyama kullanarak düzleştirilmiş beyin bölümlerindeki kortikal modülleri görselleştirmek için bir yöntem göstermektedir. Önceden sabitlenmiş bölümler, aktif nöral kümeleri vurgulayan ve koyu, yüksek kontrastlı bölgeler oluşturan bir süzme reaktifi ile muamele edilir. Montaj ve dehidrasyondan sonra, kortikal modüller parlak alan mikroskobu altında koyu, yamalı desenler olarak görünür.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Sitokrom Oksidaz Boyama Kullanılarak Kortikal Modüllerin Görüntülenmesi

NOT: Sitokrom oksidaz aktivitesinin histokimyasal tespiti için farklı boyama protokolleri geliştirilmiştir. Bu protokol nikel-amonyum sülfat (NiAS) kullanır, bu da lekeli kortikal alanlarda daha yüksek kontrast ve daha iyi tanımlanmış modüller ile sonuçlanır.

1. Sitokrom oksidaz boyama solüsyonunu hazırlayın. 10 mL çözelti için 10 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tamponu (0.1 M, pH 7.4), 400 mg sükroz, 12.5 mg NiAS, 2 mg sitokrom C ve 6 mg diaminobenzidin (DAB).
   DİKKAT: DAB ve NiAS kanserojendir.
   NOT: Bölümlerin inkübasyonundan hemen önce DAB ekleyin.
2. HEPES tamponundaki bölümleri (0,1 M, pH 7,4) bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika yıkayın.
3. Boyama solüsyonundaki bölümleri oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
   NOT: Lekelenme hızını gözlemleyin. Görünür bir reaksiyon yoksa, 37 ° C'de inkübasyona geçin. Fiksasyon miktarına bağlı olarak, lekelenme 10 dakika sonra veya birkaç saat içinde gözlenebilir.
4. % 4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek reaksiyonu durdurun; Bu, istenmeyen yeniden ölmeyi ve arka plan sinyalinin artmasını önler.
5. Bölümleri HEPES tamponunu kullanarak 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
6. Bölümleri cam slaytlara monte edin ve kurulayın.
7. Artan bir alkol sırası ile bölümleri kurutun:
   1. Slaytları 1 dakika boyunca %60 etanolde yıkayın. Slaytları 1 dakika% 80 etanol içinde yıkayın. Slaytları 2 dakika% 96 etanol içinde yıkayın. Slaytları 3 dakika% 100 etanol içinde yıkayın. Slaytları izopropanol içinde 5 dakika yıkayın. Slaytları 5 dakika boyunca ksilen içinde yıkayın.
8. Hemen hızlı bir sertleştirme montaj ortamı ekleyin ve bir lamel ekleyin. Kritik: NiAS yıkanacağı ve lekelenmeyi bozacağı için su bazlı montaj ortamları kullanmayın.
9. Uzun süreli saklama için bölümleri 4 °C'de tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sitokrom oksidaz boyama
At kalbinden sitokrom c	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidin tetrahidroklorür hidrat	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
Montaj veya dondurma ortamı
Eukitt (histokimya)	Sigma-Aldrich	3989
Alkol dehidrasyonu
Etanol %100	Carl Roth	9065.3
Etanol %96	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Ksilen ikamesi	Fluka	78475
Cihazlar/araçlar
Dumont 55 Forseps - Inox	Güzel Bilim Araçları	11255-20
Dumont 5 Forseps - Inox Biyoloji Ucu	Güzel Bilim Araçları	11252-30
Dumont 5SF Forseps - Inox Süper İnce Uçlu	Güzel Bilim Araçları	11252-00