Fare Sinir Dokularındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi

Özet

Kaynak: Hidmark, A. S., et al. {{}}Tek Bir Siyatik Sinirlerde ve Dorsal Kök Ganglionunda İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 27}} (2017).

Bu video, fare siyatik sinirlerinde ve dorsal kök gangliyonlarında (DRG'ler) bağışıklık hücrelerini analiz etmek için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. İşlem, bağışıklık hücrelerinin florofor ve biyotin etiketli antikorlarla etiketlenmesini, hücrelerin stabilize edilmesini ve geçirgenleştirilmesini ve hücre yüzeyi ve nükleer özelliklerini tespit etmek için floresan işaretleyicilerin kullanılmasını içerir. Teknik, sinir dokularında bağışıklık hücresi heterojenliğinin kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Siyatik Sinir ve DRG

1. } Sindirim ortamını hazırlayın (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı [DMEM], 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit [HEPES], 5 mg / mL sığır serum albümini [BSA], 1.6 mg / mL kollajenaz Tip 4) 100 μg / mL deoksiribonükleaz ile desteklenmiş, ve buz üzerinde saklayın.
   NOT: Fare başına gereken sindirim ortamı miktarı (siyatik sinirler + DRG'ler) 1 mL'dir. Hazırlandıktan sonra, sindirim ortamının alikotları -20 °C'de saklanabilir.
2. Siyatik sinirleri ve DRG'leri bir fareden 500 μL sindirim ortamı içeren ayrı 1,5 mL tüplere aktarın. Siyatik sinirler için, materyali yaylı makas kullanarak 15-20 parçaya bölün ve ardından doku süspansiyonlarını 37 ° C'de 20 dakika boyunca hafif çalkalama ile (≤ 450 rpm) çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.
3. Tam olarak sindirilmemiş dokuyu mekanik olarak ayırmak için hücre süspansiyonunu 1.000 μL pipet ucundan tekrar tekrar ezin.
   NOT: Süspansiyonun titre edilmesi zorsa, kör bir uç oluşturmak için pipet ucunu makasla kesin. Doku süspansiyonunu 37 ° C'de 20 dakika boyunca hafif çalkalama ile (≤ 450 rpm) inkübe edin.
4. Öğütme işlemini 1.000 μL'lik bir pipet ucuyla tekrarlayın ve hafif çalkalama (≤ 450 rpm) ile 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin.
5. FACS tamponunu hazırlayın (% 10 fetal buzağı serumu [FCS] ve 1 mM etilendiamin tetraasetik asit [EDTA] ile desteklenmiş fosfat tamponlu salin [PBS]) ve buz üzerinde saklayın. Floresanla etkinleştirilen hücre sıralama (FACS) tamponu ile 140 μm ağ boyutuna sahip paslanmaz çelik bir ekranı 60 x 15 mm Petri kabında durulayın ve buz üzerinde ıslatın.
   NOT: Çekirdekli hücrelerin veriminde önemli bir kayba yol açtığı için naylon elek filtrelerinden kaçınılmalıdır.
6. Doku süspansiyonlarını, Petri kabı üzerinde künt forsepslerle buz üzerinde tutulurken 140 μm'lik elek filtresinden tekrar tekrar geçirin. Hücre süspansiyonunu Petri kabından toplayın ve buz üzerinde saklanan 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
7. Filtrede kalan tam olarak sindirilmemiş dokuyu 1.000 μL'lik bir pipet ucuyla tekrarlanan ezme yoluyla itin. Elek filtresini 500 μL FACS tamponu ile iki kez durulayın ve elde edilen hücre süspansiyonunu, adım 1.6'daki hücre süspansiyonu ile birleştirmek için Petri kabında toplayın.
   NOT: Kullanılan akış sitometresi döküntülere karşı hassassa, adım 1.7'deki hücre süspansiyonu 70 μm'lik bir elek filtresinden geçirilebilir; Bununla birlikte, bu, çekirdekli hücrelerin veriminde bir kayba yol açabilir.
8. Hücre süspansiyonlarını 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Bu yıkama adımını bir kez tekrarlayın.
9. Gerekli boyama sayısına bağlı olarak hücre peletini 150-350 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin (boyama paneli başına 150 μL FACS tamponu).

2. Siyatik Sinir ve DRG'nin Akış Sitometrisi için Floresan Olarak İşaretlenmiş Antikorlarla Boyanması

1. {{}} 100 μL'lik siyatik sinir veya DRG hücre süspansiyonunu buz üzerinde 96 oyuklu bir plakada V şeklinde bir kuyuya aktarın.
   NOT: Tek lekeli hücreler, kullanılan tüm antikorlar için gereklidir, çünkü fotoçoğaltıcı tüp (PMT) voltaj kazançları ve kompanzasyonuna göre akış sitometrisinin ayarlanması için gerekli kontrolleri sağlayacakları gibi, ayrıca spesifik ve spesifik olmayan bağlanmayı ayırt etmeye yardımcı olmak için.
2. Lekesiz bir kontrol görevi görmek için siyatik sinirlerden veya DRG örneklerinden kalan hücre süspansiyonlarını (numune başına yaklaşık 50 μL) bir araya getirin.
3. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Plakayı bir çöp kutusunun üzerinde ters çevirerek ve bileğe keskin bir fiske uygulayarak süpernatanı atın ve kağıt havluların üzerine hafifçe vurarak kurulayın.
4. Yüzey boyama için, ilgilenilen antikorları (CD45-A647, CD11b-PerCP / Cy5.5 ve majör histouyumluluk kompleksi [MHC] Sınıf II-Biotin) içeren 20 μL FACS tamponunda hücre peletlerinin her birini yeniden süspanse edin ve ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
   NOT: (1) Optimal antikor seyreltmesi, kullanımdan önce bir seyreltme gerçekleştirilerek belirlenmelidir. üreticinin ürün bilgilerine göre seri; (2) Spesifik olmayan lekelenme, üreticinin talimatlarına göre bu adımda Fc blok ile inkübasyon yoluyla azaltılabilir; ve (3) Doğrudan bir florofor ile konjuge edilmiş primer antikorlar kullanıldığında ve/veya ilgilenilen antijen(ler) farklı popülasyonlar ürettiğinde izotip kontrol boyaması genellikle gerekli değildir.
5. Her oyuğa 130 μL FACS tamponu ekleyin ve plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı daha önce tarif edildiği gibi atın (adım 2.3) ve hücre peletlerini 150 μL FACS tamponu ile iki kez yıkayın.
   NOT: } Konjuge olmayan bir primer antikor veya biotine konjuge bir primer antikor kullanılıyorsa, bu noktada bir florofora konjuge edilmiş uygun bir ikincil reaktif eklenebilir ve 2.4-2.5 adımları tekrarlanır. Bu protokol durumunda, sırasıyla CD45-A647 / CD11b-PerCP / Cy5.5 ile kombinasyon halinde veya CD68-APC ve F4 / 80-PE / Cy7 ile kombinasyon halinde MHC Sınıf II'yi tespit etmek için streptavidin-PE / Cy7 veya Streptavidin-PerCP kullanıldı.
6. Fiksasyon için, son yıkama adımından sonra, hücre peletlerini PBS'de (pH 7.4) 100 μL% 4 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin. Plakayı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı daha önce tarif edildiği gibi atın (adım 2.3) ve hücre peletlerini 150 μL FACS tamponu ile bir kez yıkayın.
   Dikkat: Paraformaldehit toksiktir; Eldiven ve gözlük gibi uygun koruma kullanın, vb.
   NOT: Hücre peletlerini 150 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve ışıktan koruyarak 4 ° C'de iki güne kadar saklayın. Hücre içi boyama gerekmiyorsa, plakayı 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjledikten sonra adım 2.11'e geçin.
7. } Hücre içi boyama için, hücre peletlerini 150 μL FACS tamponu +% 0.5 deterjan içinde yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında inkübe edin, 15 dakika boyunca ışıktan korunur. Plakayı 400 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı daha önce tarif edildiği gibi atın (adım 2.3) ve hücre peletini 150 μL FACS tamponu +% 0.5 deterjanla bir kez yıkayın. Hücre peletini 20 μL FACS tamponu +% 0.5 ilgilenilen antikorları (CD68-APC, CD206-PE) içeren deterjan içinde yeniden süspanse edin ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. Her kuyucuğa 130 μL FACS tamponu +% 0.5 deterjan ekleyin ve plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı daha önce olduğu gibi atın tarif edildi (adım 2.3) ve hücre peletlerini 150 μL FACS tamponu +% 0.5 deterjanla iki kez yıkayın.
   NOT: }Konjuge olmayan bir primer antikor veya biotine konjuge bir primer antikor kullanılıyorsa, bu noktada bir florofora konjuge edilmiş uygun bir ikincil reaktif eklenebilir ve 2.9-2.10 adımları tekrarlanabilir.
9. Hücre peletlerini 150 μL FACS tamponu +% 0,5 deterjan içinde tekrar süspanse edin ve ışıktan koruyarak 4 °C'de iki güne kadar saklayın.
10. Hücre peletlerini 5 μg/mL4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile desteklenmiş 150 μL FACS tamponu +% 0,5 deterjan ile yeniden süspanse edin ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı daha önce açıklandığı gibi atın (adım 2.3).
11. Hücre peletlerini 150 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve uygun şekilde etiketlenmiş bir FAC tüpüne aktarın. Analize hazır olana kadar oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak saklayın.
    NOT: PBS'de yeniden süspansiyondan sonra, hücreler saatler içinde analiz edilmelidir, çünkü DAPI DNA'dan yavaşça ayrışır ve sinyalde bir kayba yol açar.

3. Flow Sitometrisinin Kurulumu ve Örneklerin Çalıştırılması

1. Hücreleri boyamak için kullanılan floroforları ölçmek için akış sitometresinin uygun lazerler ve/veya filtre setleri ile donatıldığından emin olun. Bu, sistemdeki varsayılan sitometre yapılandırması altında belirlenebilir. Bu protokol söz konusu olduğunda, hücreler, ≤ 5 floroforun saptanmasına izin veren üç lazerle (405 nm, 488 nm ve 633 nm) donatılmış bir akış sitometresi kullanılarak analiz edildi.
2. İlgilenilen floroforların tespiti için uygun kanalları seçin. Tüm floresan sinyaller en iyi logaritmik amplifikasyon ile tespit edilir.
3. Numuneler için uygun bir akış hızı seçin. Bu parametre kullanılan sisteme bağlı olarak değişebilir ve ampirik olarak belirlenmelidir. Bu protokol durumunda, iğnenin tıkanmasını önlemek için MED-to-HI (35-60 μL/dk) akış hızı kullanılmıştır.
4. Örnek başına toplanacak toplam olay/hücre sayısını seçin. Minimum olay sayısı 1.000.000 olmalıdır.
5. Yan saçılma alanı (SSC-A) ve ileri saçılma alanı (FSC-A) ve FCS-A'ya karşı ilgilenilen her florofor için genel bir çalışma sayfası altında dağılım grafikleri oluşturun. Seçilen floroforlar için olay sayısını ve ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) görüntüleyecek istatistiksel bir görünüm oluşturun.
6. FSC-A ve SSC-A kanallarının voltajını, en küçük hücreler dağılım grafiğinin sol alt %10'una sığacak şekilde ayarlayın. Siyatik sinirlerden veya DRG'lerden gelen boyanmamış kontrollerden arka plan floresansını ve minimum numune floresansını belirleyin. Yalnızca DAPI boyama kontrollerinden gelen dağılım grafiğine dayalı olarak üst (P1) geçidini belirleyin.
   NOT: Bu, kısmen periferik sinir sistemindeki (PNS) DAPI+ popülasyonunun heterojen doğası nedeniyle bir toplama kapısı değildir.
7. İlgilenilen floroforların her biri için FSC dağılım grafiklerini kullanarak, voltajları, boyanmamış kontrolün hücreleri ilgili dağılım grafiklerinin alt çeyreğine düşecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, ilgili belirteçlerin/floroforların her biri için pozitif olan hücreleri tanımlamak için bu bölgenin üzerinde kapılar oluşturulur. Bir kapının yerleştirilmesi, tek lekeli kontrolün çalıştırılmasıyla onaylanır (adım 2.1).
   NOT: Çakışan emisyon spektrumları için kompanzasyon bu noktada gerçekleştirilebilir veya uygun analiz yazılımı ile geriye dönük olarak uygulanabilir.
8. Akış sitometresi açıklandığı gibi ayarlandıktan sonra, numuneler çalıştırılabilir.
9. Çalıştırmadan sonra, kalan numune materyali atılabilir ve FCS dosyaları daha fazla analiz için dışa aktarılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glikoz, Glutamin, Pirüvat)	Thermo	31885023	Bu malzemenin kaynağı önemli değil
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
sığır pankreasından deoksiribonükleaz (DNase) I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Fetal Calf Serum (FCS), ısı inaktive edilmiş	Sigma-Aldrich	F4135
CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
MHC sınıf II'ye karşı antikor, biyotinillenmiş	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
CD45-A647'ye karşı antikor	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	CD45-A647 ve CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	CD68-APC ve F4/80-PE/Cy7 ile MHCII-biotin'i tespit etmek için kullanılır
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	PBS'de 50x'e seyreltin ve karanlıkta 4 °C'de saklayın
Hücre ayrışma süzgeci - doku öğütücü kit	Sigma-Aldrich	CD1
V-Şekilli, 96 oyuklu plakalar	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene yuvarlak tabanlı tüp, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences

style='height:20px;'>