Optik Koherens Tomografi Kullanılarak Fare Retinasının İn Vivo Görüntülenmesi

Özet

Source: Jagodzinska, J., et. al., Optik Koherens Tomografi: Fare Retinal Ganglion Hücrelerini Görüntüleme In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)

Bu videoda, optik nöropatili genetik olarak değiştirilmiş bir fare modelinde retina katmanlarını görüntülemek ve yapısal değişiklikleri değerlendirmek için spektral alan optik koherens tomografinin (SD-OCT) kullanımını gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fare Hazırlığı

1. Göz genişlemesi ve immobilizasyonu
   1. Veri alımından en az 15 dakika önce, fare gözlerine %10 fenilefrin göz damlası damlatın, fazlalığı giderin, ve% 0.5 tropikamid göz damlası damıtın.
      NOT: Oturumda test edilecek tüm fareler için ilk dilatasyon bir kerede yapılabilir. Sıvıların oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
   2. Genel anesteziyi başlattıktan hemen sonra (adım 1.2), gözleri uyuşturmak ve hareketsiz hale getirmek için% 0.4 oksibuprokain hidroklorür göz damlası uygulayın ve 3 saniye boyunca yerinde tutun. Daha sonra, damlaları silin ve% 10 fenilefrin ve% 0.5 tropikamid damlatma işlemini tekrarlayın.
      NOT: Sıvıların oda sıcaklığında olduğundan ve farenin oksibuprokaini yutmadığından emin olun.
2. Genel anestezi
   1. Serum fizyolojik içinde ketamin (20 mg/mL) ve ksilazin (1.17 mg/mL) anestezik solüsyonu hazırlayın. 4 °C'de en fazla 2 hafta saklayın.
   2. Testten yaklaşık 5 dakika önce, farenin yaşına ve boyutuna bağlı olarak intraperitoneal olarak 1 g vücut kütlesi başına 5-10 μL anestezik solüsyon enjekte edin.
      NOT: Genç ve/veya zayıf fareler daha az anesteziye ihtiyaç duyar, anestezi için daha az zaman harcar, ancak aynı zamanda daha hızlı uyanır. Burada, 8 μL/g (160 mg/kg ketamin, 9.33 mg/kg ksilazin).
   3. İsteğe bağlı olarak, kornea kuruluğunu önlemek için gözleri viskoz göz damlası veya oftalmik jel ile yağlayın.

2. Fare Konumlandırma

1. Kornea hidrasyonu sağlamak için gözleri viskoz glikol bazlı göz damlası ile yağlayın.
   NOT: Muayene sırasında gözler kuru görünüyorsa, göz damlalarını tekrar uygulayın.
2. Fareyi sıcak tutmak için bir cerrahi gazlı bez tabakasına sarın.
3. Bir sünger veya pamuk fitil kullanarak, ışık kırılmasını en aza indirmek, opaklıkları önlemek ve kornea hidrasyonunu sağlamak için her göze %0.3 hipromelloz içeren ince bir oftalmik jel tabakası uygulayın. Bunu yaparken kirpikleri ve bıyıkları bir kenara çekin.
4. Fareyi, başı düz ve ileriye bakacak şekilde kasete yerleştirin.
5. Isırma çubuğu kelepçesini yavaşça açın ve çubuğu ağzınıza yerleştirin; Pozisyonu sabitlemek için burun bandını kullanın.
   NOT: Bit çubuğunun kasetin ortasında olduğundan emin olun.
6. Sağ (sol) göz test ediliyorsa, sağ (sol) tarafın altına pamuklu bir rulo yerleştirin.
7. Klipsli nişan alma ucunu fareye özel lensin üzerinde tutarken, Z-çevirme vidasını saat yönünün tersine çevirerek göze doğru getirin.
8. Kaseti döndürerek ve döndürerek ve ısırma çubuğunu ve X-çevirmen vidalarını çevirerek farenin konumunu önceden ayarlayın; Amaç, sağ gözün doğrudan lense bakmasını sağlamak ve böylece gözlerin ve lensin optik eksenlerini hizalamaktır.
   NOT: Fare çok yüksek veya çok düşükse, önce Y çevirme vidası kullanılmalıdır.
9. "Sınav"da ilk taramayı seçin, "Hedeflemeye Başla"ya tıklayın ve retina görüntüleme için başka manuel ayarlamalar yapın.
   1. Z çevirme vidasını kullanarak retinayı sol panelde dikey olarak hareket ettirin (Şekil 1, Yatay B-tarama Hizalaması) ve yatay olarak sağ panelde (Şekil 1, Dikey B-tarama Hizalaması).
   2. ONH'yi yukarı veya aşağı hareket ettirerek ONH'yi sağ panelin ortasına getirmek için kaseti döndürün. Sağ paneldeki retinayı düzeltmek için ısırma çubuğu vidasını kullanın. ONH'yi sol panelin ortasına yerleştirmek için kaseti döndürün.
   3. Sol paneldeki retinayı düzleştirmek için X çevirmen vidasını kullanın. Her modülatörün ana işlevini göz önünde bulundurarak, ONH'yi merkezileştirmek için retinanın konumunu daha da ayarlayın.
      NOT: Gerekirse Gerekirse ONH'yi sağ panelde yukarı ve aşağı hareket ettirmek için Y çevirme vidasını kullanın. Konum, taramalar arasında herhangi bir zamanda iyileştirilebilir.

3. ONH ve Retinanın SD-OCT Görüntülemesi

1. Ayarlamalardan memnun kaldıktan sonra, SD-OCT taramasına başlamak için "Anlık Görüntüyü Başlat"a tıklayın.
   1. 3D görüntüleme gerekli değilse, OCU seçeneğinin işaretini kaldırın.
2. Taramayı ve raporu kaydedin.
3. Sonraki taramalarla devam edin.
4. İkinci gözü görüntülemek için, lensi geri çektikten sonra kaseti uygun şekilde çevirin ve 2.6 - 3.3 arasındaki adımları tekrarlayın.

4. Edinme Tamamlama

1. Edinme tamamlandığında, fareyi kasetten çıkarın, her bir göze %0,3 hipromelloz içeren oftalmik jel uygulayın ve uyanmak için fareyi bir ısıtma plakasına yerleştirin.
2. Son alımdan sonra, yazılımı kapatın ve bilgisayarı ve OCT makinesini (güç kaynağı düğmesi) kapatın.
3. Kaseti dezenfektanla temizleyin.

5. Analiz

1. {{}} Retina tabakası kalınlığı ölçümü için üretici tarafından sağlanan otomatik segmentasyon yazılımını kullanın.
   1. "Hasta"ya tıklayın, listeden istediğiniz "Sınav"ı seçin ve "Sınavı İncele" seçeneğine tıklayın.
   2. İstenen taramadaki klasör simgesine sağ tıklayarak istenen OCT verilerini OCT yazılımına yükleyin.
   3. B-taramasına sağ tıklayın; 10 adede kadar ölçüm kaliperini etkinleştirerek kaliperleri yapılandırın; tıklayın ve adlarını, açılarını ve renklerini girin.
   4. B-taramasına sağ tıklayarak istenen kumpasın seçilmesi; Ölçüm için uygun şekilde retinaya yerleştirin.
      NOT: ONH merkezli taramalar için, her iki tarafına birbirinden eşit uzaklıkta 5 kumpas ayarlayın. Peripapiller analiz için, kaliperin ONH'den çok uzağa yerleştirilmediğinden emin olun. Radyal tarama için, OCT yazılımı tarafından seçilen tarama başına 10 resmi analiz edin. Numaraları "Raporlar" klasöründe bulunabilir.
   5. B-taramasına sağ tıklayarak ve "Sonuçları kaydet"e tıklayarak sonuçları analiz için bir elektronik tablo yazılım programına kaydedin.
      NOT: Sonuçlar, tarama verileriyle aynı klasörde bulunabilir.
2. Alternatif olarak, açık kaynaklı bir görüntü işleme programı için geliştirilen ev yapımı kumpas makrosu "MRI Retina Tool"u kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
   1. "MRI Retina Tool" ve "Modify Polygon Section Tool" makrolarının aktif olduğundan emin olun. Görüntüyü yükleyin. Ölçümü başlatmak için m düğmesine tıklayın.
      NOT: Makro, ONH'nin her iki tarafında otomatik olarak 0,2 mm uzunluğunda bir ölçüm kaseti oluşturur. Her kaset, kaliper görevi gören 5 ölçüm noktası içerir. Yanal pozisyonları değiştirilemez ve radyal taramalarda peripapilla için özelleştirilmiştir. Kasetlerin yatay konumu, RNFL/GCL kalınlığını ölçmek için önceden tanımlanmıştır, ancak bunun yerine GC karmaşık katmanını ölçmek için kolayca değiştirilebilir. Tarama kalitesi düşükse, yatay konumun ayarlanması veya resmin analizden çıkarılması gerekir.
   2. Yatay ayarlama için e düğmesine tıklayın. Yeni açılan "ROI Manager" penceresinde ilk kaseti seçin.
   3. Mavi çokgen düğmesine tıklayın ve resimde ölçülen katmanın kenarlıklarına tıklayarak ilk kasetin konumunu ayarlayın.
   4. Önce "ROI Manager" penceresinde seçerek ve ardından uygun görüntüye tıklayarak ikinci kaset için tekrarlayın. Yeniden ölçmek için r düğmesine tıklayın. Sonuçları "Ölçümler" penceresinde görüntüleyin.
      NOT: Sonuçlar herhangi bir zamanda bir elektronik tablo yazılım programına kopyalanabilir. Sağ kaset (r), sol kaset (l) ve toplam için aşağıdaki değerleri içerirler: Intden - kaset içindeki entegre yoğunluk; Alan: ölçümün alanı, mm2 cinsinden; Len: kaset içindeki kaliperin mm cinsinden uzunluğu; Ortalama: kaset içindeki sinyalin ortalama yoğunluğu; ve Std: sinyalin ortalama yoğunluğunun standart hatası.
   5. Bir sonraki resimle devam edin.
   6. Verileri bir elektronik tablo yazılım programında daha fazla analiz edin.
      NOT: Katmanın ortalama kalınlığını bulmak için on Len değerini alın.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mice
Opa1delTTAG mouse	Montpellier Nörobilimler Enstitüsü, INSERM UMR 1051, Fransa	-	C57Bl6/J arka plan üzerinde OPA1 c.2708_2711delTTAG mutasyonu taşıyan knock-in fareler
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Almanya	-	Spektral-Alan Optik Koherens Tomografi sistemi
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Almanya	-	OCT alımı ve analizi için yazılım
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD	-	Analiz için yazılım, iki özel makronun indirilmesini ve kurulmasını gerektirir: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Kendi kendini düzenleyen ısıtma plakası	Bioseb, France	BIO-062	Hipotermiye karşı koruma
Supplies
Gazlı bez pedleri 3"x3"	Curad, ABD	CUR20434ERB	Hipotermiye karşı koruma
Çift Uçlu Pamuk uç aplikatörü	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, Fransa	T.7979C.CS	Mouse positioning
Reaktifler ve İlaçlar
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monako	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5	Laboratoires Théa, Fransa	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, Fransa	3192342	Lokal anestezi
Imalgene 1000	Merial, Fransa/CentraVet, Fransa	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Almanya/CentraVet, Fransa	ROM001	Genel anestezi, analjezi, kas gevşemesi
NaCl 0,9	Laboratoire Osalia, Fransa	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, ABD	- style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-size:10pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Gözlerin nemlendirilmesi
GenTeal'	Alcon, Novartis, ABD	-	Işık kırılmasını ve opaklıkları en aza indirmek için oftalmik jel
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, Fransa	59844	Dezenfektan

<='td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-size:10pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Essence of Beauty, CVS Health Corporation, ABD%%%