Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Hızlandırılmış Görüntüleme
- Mikroskop Kurulumu
- Ters konfokal mikroskobun sahnesine yerleştirilmiş bir iklim odasını 37 °C ve %5 karbondioksit atmosferine ayarlayın. Lazer yoğunluğunu azaltmak ve hücre canlılığını artırmak için hibrit bir dedektör kullanın. Ayrıntılı analiz için, 0,6 veya daha yüksek sayısal açıklığa sahip ekstra uzun bir çalışma mesafesi 40X kuru objektif kullanın.
Not: Görüntüleme işlemi sırasında sabit bir odak sağlamak için mikroskobun tüm bileşenlerinin görüntülemeden önce 2 - 3 saat boyunca 37 °C'ye önceden ısıtılması gerekir.
- Dilim Görüntüleme
- Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak zar eklerini içeren 6 oyuklu plakadan görüntüleme için bir beyin dilimi seçin.
Dikkat: Ultraviyole ışığa uzun süre maruz kalmaktan kaçının çünkü bu, hücresel fotohasara neden olabilir.
NOT: Üst SVZ'de (Subventriküler bölge) dilimin pial yüzeyine radyal olarak göç eden parlak tek nöronları olan bir dilim seçin. Tüm CP'yi (Kortikal plaka) kapsayan radyal glial hücrelerin ince floresan işlemleri, radyal olarak göç eden kortikal nöronlar tarafından kullanılan sağlam bir radyal glial iskeleyi gösterir. - Time-lapse görüntüleme için seçilen dilim ile membran ekini forseps yardımıyla 2 ml dilim kültür ortamı içeren 50 mm çapında bir cam tabanlı tabağa aktarın. Çanağı konfokal mikroskobun iklim odasına yerleştirin.
- Çözünürlüğü 512 x 512 piksele ayarlayın ve kare hızını sırasıyla saniyede yaklaşık 1,4 kareden yaklaşık 2,5 kareye çıkarmak için tarama hızını 400 Hz'den 700 Hz'e yükseltin. Ortalama olarak en fazla iki kez kullanın. Elektroporasyonlu bölge (genellikle 400-100 μm) boyunca 1,5 μm'lik bir adım boyutuna sahip bir z-yığını tanımlayın. Toplu olarak, bu ayarlar görüntünün yeterli çözünürlüğüne ve parlaklığına izin verirken, çekim sırasında foto hasarı düşük tutar. Her 30 dakikada bir z-yığını alarak hızlandırılmış seriye başlayın.
NOT: Dilimin lazer ışığına uzun süre maruz kalması, hücrelerin canlılığını azaltan fotohasara neden olur. Lazer ışığına maruz kalma süresini buna göre ayarlayın. - ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/iij/) veya eşdeğerini kullanarak zaman atlamalı serileri analiz edin.
