Konfokal Mikroskop Kullanılarak Zebra Balığı Larvasında Seçici Tek Nöron Lazer Ablasyonu

Özet

Source: Morsch, M., vd. al., Konvansiyonel UV Lazer Konfokal Mikroskopi Kullanarak Hücre Stresini ve Ölümünü Tetikleme. J. Vis. Exp. (2017)

Bu videoda, transgenik zebra balıklarında tek tek nöronları hassas bir şekilde hedeflemek ve incelemek için yüksek yoğunluklu UV lazer ablasyon tekniğini keşfediyoruz. Yaralanma ve iyileşmenin hücresel dinamiklerini vurgulayarak nöronal tepkilerin nasıl hazırlanacağını, hareketsiz hale getirileceğini ve görselleştirileceğini gösteriyoruz.

Protokol

1. Zebra balığının agaroza gömülmesi için çözümler hazırlayın.
   1. Yumurta suyu içeren bir Petri kabına damla damla 4 g / L MS222 (tricaine stok solüsyonu, pH 7.0) ekleyerek bir anestezi solüsyonu hazırlayın. 50 mg / L'lik bir doz önerilen bir başlangıç noktasıdır (Şekil 1A).
   2. Yumurta suyunda düşük erime noktalı agaroz (% 0.8 - 1.5) stoğu hazırlayın ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine alın. Önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna (38 - 40 °C) bir alikot yerleştirin ve ayarlanan sıcaklığa (~ 30 dakika; Şekil 1B).
   3. İsteğe bağlı: Daha uzun süreli görüntüleme için (> 4 saat), 35 mm cam tabanlı Petri kabının içinde küçük bir agaroz çemberi hazırlayın ve sertleşmesine izin verin.
      NOT: Bu ekstra adım, zebra balığı ile tüm agaroz damlasının daha uzun zaman dilimleri boyunca herhangi bir hareketini önlemede etkili olmuştur.
      1. Bunu yapmak için, balığın yerleştirileceği ortada küçük bir açıklık bulunan çörek şeklinde bir daire hazırlamak için cam tabanlı tabağın iç çemberi boyunca ~ 300 μL agaroz yerleştirin (adım 1.5.3).
2. Zebra balığını mikroskopi için agaroza monte edin.
   1. Ablasyon için önceden taranmış balıklardan 1 - 3 tanesini seçin ve larvaları (bir transfer pipeti kullanarak) anestezi solüsyonu ile bir tabağa aktararak uyuşturun (adım 1.4.1; Şekil 1C; yaklaşık 5 dk).
      NOT: Balıklar, sığ bir operküler hareket ve azalmış kalp atış hızı gösterdiklerinde ve artık dokunmayla uyarılmış bir kaçış tepkisi göstermediklerinde uyuşturulur (TEER; kuyruklarına bir fırça ile hafifçe dokunduktan sonra yüzerek kaçamama). Balığın etik tedavisi için uygun anestezi sağlayın ve agaroza transfer edildiğinde veya floresan ışığa maruz kaldığında seğirmeyi önleyin.
   2. Anestezi onaylandıktan sonra, ayarlanabilir bir pipet kullanarak (200 μL'lik bir kesme ucu ~ 30 μL'ye ayarlanmış) bir larvayı emdirin ve ucun dibine batmasına izin verin. Larva ile birlikte sıvının bir damlasını agarozun içine bırakarak larvaları önceden ısıtılmış agaroza aktarın (adım 1.4.2) (agaroza giren yumurta suyu miktarını en aza indirmeye çalışın; Şekil 1D).
   3. Agaroz ile çevrili balıkları emdirin. Önceden hazırlanmış cam tabanlı 35 mm'lik tabağa hızlı bir şekilde dağıtın.
   4. Bir diseksiyon mikroskobu ve standart bir boya fırçası (uzun astar, 1 numara) kullanarak hayvanı agarozun içinde yanda (baş sola) yerleştirin, böylece gövde ve kuyruk düz olur (Şekil 1E). Birden fazla balıkla çalışıyorsanız, tabaktaki tüm balıkları daha sonra konfokal mikroskobu kullanarak kolayca bulunacak şekilde hizalayın.
      NOT: Bu konumlandırma ve hizalama prosedürünü hızlı bir şekilde gerçekleştirin (agaroz daha düşük sıcaklıklara maruz kaldıktan hemen sonra sertleşmeye başladığından biraz pratik gerektirebilir).
   5. Agaroz gömülü balığı, agaroz sıkıca sertleşene kadar 10 - 15 dakika bekletin. 35 mm'lik Petri kabını trikain içeren ~ 2 mL yumurta suyu ile dikkatlice doldurun (Şekil 1F).

2. Konfokal Mikroskop ve Görüntüleme Parametrelerini Ayarlayın

1. {{}} Gömülü larva ile Petri kabını konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin ve hayvan omuriliğinin dorsal tarafına odaklanın (parlak alan kullanarak). Hayvanı uygun büyütme (40X) ve floresan ayarı altında inceleyin ve ilgilenilen yapıyı görselleştirin (, örn.,) tüm görüntüleme parametrelerinin sonraki ablasyon için gerektiği gibi olduğunu doğrulamak için (Şekil 2). Timelapse çalışmalarımızı gerçekleştirmek için rutin olarak 40X objektifini kullanıyoruz.
2. İsteğe bağlı: Birkaç saatlik hızlandırılmış bir çalışma yapmak için, hücrenin ve çevresinin bozulmamış fizyolojik tepkisini belirlemek için ablasyondan önce bir veya birkaç zaman noktasının kaydedilmesi önerilir (, örneğin, mikroglial hareket, başlangıç hızını ve hareketliliğini belirlemek için).
3. UV lazer ablasyonu için ilgilenilen yapının kalınlığını belirleyin.
   1. Z-sürücüsünü kullanarak, ilgilenilen yapının üst ve alt kısımlarını doğrulayın (örn., hücre soma) manuel olarak yukarı ve aşağı odaklanarak. Kesilecek z düzlemini not edin (örn., hücrenin merkezi).
      NOT: Deneyimlere göre, bu yöntem en çok, parlak bir şekilde etiketlenmiş omurilik nöronlarını hedefleyerek etkiliydi (ablasyondan sonra kolay hızlandırılmış görselleştirmeye izin veren yüksek bir sinyal-gürültü oranı; örneğin, Şekil 4) ve soma hücresinin ortasını keserek. Hücre çekirdeği floresansı, doğru hedefleme ve yüksek ablasyon verimliliği sağlamak için avantajlı olabilir.

3. Zebra Balığı Omuriliğindeki Tek Tek Hücrelerin Hedefli Lazer Ablasyonunu Gerçekleştirin

NOT: Bu ablasyon ve görselleştirme yaklaşımı için konfokal mikroskop (Leica SP5) kullanıldı. Hücreye özgü yıkım için 405 nm diyot kullanan ablasyon prosedürü, yazılıma göre detaylandırılmıştır (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Bununla birlikte, 405 nm lazer ve bir FRAP (foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı) veya ağartma modülü ile donatılmış herhangi bir geleneksel konfokal mikroskop, aynı hücre manipülasyonlarının performansına izin verecektir, ancak potansiyel olarak biraz farklı ayarlar, parametreler ve isimlerle.

1. Yazılım menüsünün üst kısmındaki açılır menüye tıklayarak FRAP sihirbazını başlatın (Şekil 3A, 1, ve 2). Lazer ablasyonu için belirli parametrelerin ayarlanmasına izin veren farklı adımlara sahip yeni bir pencereyi gözlemleyin (Şekil 3B, 3).
2. Formatı, tarama hızını (Şekil 3B, 4) ve ortalamayı (Şekil 3B, 5). 400 Hz tarama hızında 1.024 x 1.024 görüntü formatı ve 4 satır ortalaması en uygun olanıydı.
   NOT: Önceki edinimde belirlendikleri için spektral algılamayı (uyarma veya emisyon parametreleri gibi) değiştirmeye genellikle gerek yoktur.
   1. Ablasyon için z-düzlemi henüz seçilmemişse (adım 2.4'te açıklandığı gibi), "Canlı" düğmesine basın ve floresan yapı veya ablasyon yapılacak istenen z-düzlemi odakta olana kadar numuneye odaklanın.
3. Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, "Ağartıcı" adımına erişin (Şekil 3C, 6) spesifik ablasyon bileşenlerini kontrol etmek için.
   NOT: Lazer yoğunluğunun bir kombinasyonu (Şekil 3C, 8), tarama hızı ve adım 3.2'de ayarlanan ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5) ve ayrıca adım 3.5'te ayarlanacak tekrar sayısı (Şekil 3E, 12), UV lazerin ROI'deki toplam bekleme süresini ve dolayısıyla ağartma verimliliğini belirleyecektir.
   1. 405 nm lazeri beyazlatma işlemi için aktive ederek kullanın (Şekil 3C, 8).
      NOT: Bahsi geçen ayarlarla en çok başarı, deney düzeneğimizde %60 - 80 arasındaki 405 nm lazer yoğunlukları ile elde edilmiştir. Bu lazer güç çıkışının cihaza özel olduğunu ve her eş odaklı kurulum için farklılık göstereceğini unutmayın.
   2. "Yakınlaştır" seçeneğini (Şekil 3C, 7) kullanarak seçilen ROI'de ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarın, böylece bekleme süresini en üst düzeye çıkarın. Alternatif olarak, bu işlem için tercih edilen yazılımın "Ağartma noktası" seçeneğini kullanın.
4. Görüntü alma penceresindeki çizim araçlarından herhangi birini kullanarak ablasyon için bir veya birden fazla ROI seçin ({{}}, 10) () Şekil 3D, 9). Örneğin, yaklaşık 4 - 8 μm'lik dairesel çizim aracıyla akson tepesini hedefleyin.
   NOT: Ablasyon alanı, uygulamaya bağlı olarak tek bir pikselden daha geniş bir alana ayarlanabilir.
5. ROI'yi oluşturduktan sonra, "Zaman Seyri" düğmesini seçin (Şekil 3E, 11) ve ROI'lerin taranacağı/kesileceği döngü sayısını onaylayın (Şekil 3E, 12). Ağartma işleminden hemen önce ve hemen sonra tüm görüntünün genel bir bakışına izin vermek için "Ağartma Öncesi" ve "Ağartma Sonrası" çerçevelerini istediğiniz gibi seçin.
6. Gerekli tüm ablasyon parametrelerini belirledikten sonra, "Deneyi Çalıştır" (Şekil 3E, 13) tuşuna basın ve ablasyonun verimliliğini izleyin.
   NOT: FRAP kurulumumuzda, uygun lazer uyarımı ile FRAP döngüsünden önce ve sonra tek bir görüntü alınacaktır ( örn., EGFP eksprese eden hücreler için 488 nm uyarma). Bu ablasyon öncesi ve sonrası resimler, ROI'nin ne kadar tatmin edici bir şekilde ağartıldığına ve seçilen ablasyon parametrelerinin ne kadar etkili olduğuna dair hızlı bir yargıya izin verir.
7. Lazer yoğunluğunu ayarlayarak işlemi tekrarlayın (, 8), tarama hızı ve ortalamayı (Şekil 3B, 4 ve 5) ve tekrarlar (Şekil 3E, 12) FRAP döngüsünün tamamlanmasından sonra seçilen ROI'nin hala yüksek floresan yoğunluğu göstermesi durumunda.

Sonuçlar

<

figure class='image image-style-align-center image_resized' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75%;'>

Malzemeler