Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. PET/CT Kalibrasyonları ve İş Akışı Kurulumu (dMCAO Ameliyatından 6 Gün Sonra)
- Tarayıcı işletim yazılımında bir CT zayıflama alımı, 60 dakikalık C-11 dinamik PET alımı (350 - 650 keV seviye ayrımı, 3.438 ns çakışma penceresi) içerecek şekilde bir görüntüleme iş akışı oluşturun, histogram (20 kare: 5 x 15 sn, 4 x 1 dk, 11 x 5 dk; ölü zaman düzeltmesi ile) ve 0,776 x 0,776 x 0,96 mm voksel boyutunda 128 x 128 x 159 görüntü oluşturmak için 3DOSEM-OP rekonstrüksiyonu (2 yineleme, 18 alt küme).
- Arayüzün sol üst köşesinde bulunan CT kalibrasyon paneli aracılığıyla x-ışını kaynağı koşullandırması gerçekleştirin. Bu kalibrasyon haftalık olarak veya sistem son 48 saat içinde kullanılmamışsa taramadan önce yapılmalıdır.
- Koyu/aydınlık (D/L) ve merkez ofset (C/O) kalibrasyonları gerçekleştirin.
- Arayüzün sol üst köşesindeki CT kalibrasyon düğmesine (X) basın.
- Çalıştıracağınız CT dosyası için D/L ve C/O'yu seçin, yatağı portaldan çıkarın ve D/L kalibrasyonunu çalıştırın.
- Kalibrasyon aleti yatağını tarayıcıya yerleştirin ve arayüzdeki seçimi "70 mm palet" yerine "kalibrasyon aleti" olarak değiştirdiğinizden emin olarak C/O kalibrasyonunu çalıştırın.
- Kalibrasyon aletini çıkarın ve standart PET yatağını geri koyun, arayüzdeki seçimi tekrar "70 mm palet" olarak değiştirdiğinizden emin olun.
- 4 fareli bir görüntüleme yatağını bant kullanarak tarayıcı platformuna sabitleyin ve anestezi tüpünü takın (Şekil 1A). İzofluranın tüplerden aktığından ve bükülme olmadığından emin olun.
- Yatağı görüş alanının (FOV) merkezinde olacak şekilde öne doğru itin, BT kapısını kapatın ve yatağın doğru konumda olduğundan emin olmak için BT'nin keşif görüntüsünü elde edin.
- Radyasyon kaynağı olarak bilinen bir dozda C-11 çözeltisi içeren şirket içi üretilmiş bir fantom kullanarak PET/CT tarayıcısının "standart" bir kalibrasyonunu gerçekleştirin.
- Bir fareye uygulanana eşdeğer izleyici dozu ile doldurulmuş 20 mL'lik bir şırınga hazırlayın (~ 250 - 350 μCi / 9 - 13 MBq salin içinde seyreltilmiş C-11 izleyici).
- Bir doz kalibratörü kullanarak aktiviteyi standartta kaydedin ve ölçüm zamanını not edin.
- Fareleri görüntülemek için kullanılacak parametrelerin aynısını kullanarak (yukarıda açıklandığı gibi) standardın bir PET/CT taramasını yapın. PET tarayıcının görüntüleme verilerine uygulayacağı bir düzeltme faktörü oluşturmak için bunu haftalık olarak yapın.
2. PET/CT Görüntüleme için Çalışma Alanı Kurulumu
- {{}}Virüs öldürücü bir dezenfektan kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu) ve tüm yüzeylere koruyucu emici dolgu yerleştirerek steril bir ortam oluşturun.
- İzofluran ve oksijen tanklarının yeterince doldurulduğundan emin olun.
- 1 mL'lik bir şırıngayı (27,5 G iğne ucu ile donatılmış) %0,9 sodyum klorür (steril salin) ile doldurarak ve 27,5 G, 24 cm'lik bir kelebek kateterden geçirerek kuyruk ven kateterlerini hazırlayın. Kuyruk damarının görüşünü engellemediklerinden emin olmak ve kateteri yerinden çıkarmadan fareleri tarayıcıya taşımayı kolaylaştırmak için kanülasyondan önce kateterin kanatlarını kesin.
- Yedek "yıkama" şırıngaları (steril tuzlu su ile doldurulmuş), göz kayganlaştırıcı, etanol çubukları, ısı lambaları, hazırlanmış kateterler (önceden tuzlu su ile doldurulmuş), cerrahi bant, doku yapıştırıcısı, 0,5 mL doz şırıngalar, makas ve kuyruk damarına başarılı bir şekilde yerleştirildikten sonra kateteri kapatmak için çakmak (Şekil 1B).
3. Hayvan Hazırlama ve Kanülasyon
- {{}}, yani } izleyici ve uygulanan herhangi bir tuzlu su hacmi vücut ağırlığının %10'unu geçmemelidir).
- Fareleri %3 İzofluran kullanarak bir indüksiyon odasında anesteziye maruz bırakın ve %1-2'de tutun (2 L / dak %100 O2).
- Her fareye göz kayganlaştırıcı uygulayın ve pedal refleksi (ayak parmağını sıkıştırma) ile anesteziyi onaylayın. Gerekirse anestezi seviyelerini ayarlayın.
- Fareyi, %1-2 (2 L/dk %100 O{{TAG_193}TAG_194}2) izofluran vermek için bir burun konisi ile donatılmış ısıtılmış bir yatağa yerleştirin.
- Fare uyuşturulurken, aşağıdaki protokolü kullanarak kuyruk damarı kanülasyonu gerçekleştirin:
- Fareyi yan yatırın, yan damarlardan birini ortaya çıkarmak için, kafa burun konisinde kalırken.
- Kuyruğu bir ısı lambası kullanarak ısıtın, kuyruğu aşırı ısıtmamaya veya yakmamaya dikkat edin ve damarı genişletmek ve enjeksiyon bölgesini sterilize etmek için alkollü bir mendille temizleyin.
- İğneyi eğim yukarı bakacak şekilde tutun ve damar ile dar bir açıyla hizalayın.
- Cildi delmek için hafifçe baskı uygulayın ve iğneyi damarla aynı hizada olacak şekilde düzleştirin.
- İğnenin damara girmesi için eğimi birkaç milimetre geçecek şekilde yavaşça ileri doğru itin.
- Küçük (10-20 μL) bir tuzlu su sifonu uygulayarak kateterin içeride olduğunu onaylayın. Salin şırıngayı düzgün bir şekilde terk etmeli ve damar temizlenmelidir. Herhangi bir direnç veya geri basınç gözlenirse, kateterin damar içinde olmaması muhtemeldir ve kanülasyonun yeniden denenmesi tavsiye edilir. Pıhtılaşma gözlenirse, kanülasyon kurulumu ve yıkama için heparin (mL salin başına 1.000 ünite heparin) kullanın.
NOT: İlgilenilen fare suşunda heparinli ve heparinsiz kanülasyonu değerlendirdik ve pıhtılaşma gözlenmediği için kanülasyonlar için tek başına salin kullanıldı. - Fareleri tarayıcıya aktarırken kateterin hareketsiz kalmasını sağlamak için küçük bir damla doku yapıştırıcısı ve ardından cerrahi bant kullanarak kateteri kuyruğa sabitleyin.
- Yıkama şırıngasını kateterin ucundan çıkarın ve araştırmacının herhangi bir izofluran veya etanolün yakınında olmadığından emin olarak ucunu çakmakla kapatın.
- Taranacak 4 farenin de kanüle edilmesi ve hazırlanması için 3 ek fare için tekrarlayın.
- PET/BT'ye bağlı anestezi akışını (%2,5 İzofluran, 2 L/dakika %100 O2) açın ve fareleri tarayıcı yatağına yüzüstü yatırın, kateterlerin yerinde kalmasını ve her farenin kafasının burun konisi içinde düz ve güvenli olmasını sağlayın. Her farenin başını ve gövdesini yumuşak cerrahi bantla yatağa bantlayın ve bandın yerleştirilmesiyle solunumun kısıtlanmamasını sağlayın. Görüntü analizi için doğru konum ve grup tahsisine izin vermek için her farenin konumunu kaydedin.
- Fareleri prosedür boyunca sıcak tutun (, örneğin, kullanarak farelerin aşırı ısınmadan sıcak kalmasını sağlayın). Tüm farelerin solunum hızını, açık bir portal kullanılıyorsa görsel olarak veya solunum pedleri kullanan bir uzaktan izleme sistemi aracılığıyla izleyin ve anestezi seviyelerini gerektiği gibi değiştirin.
4. CT Edinimi
- {{}}Hayvanlar yatakta güvende olduklarında ve solunum stabil hale geldiğinde, lazer artı kıllarını açın ve tarama yatağını dört farenin de beyniyle aynı hizada olacak şekilde hareket ettirin. Tarayıcı yatağını, farelerin beyinleri FOV'un merkezine mümkün olduğunca yakın olacak şekilde çekim konumuna (konum 3) getirin.
- Konumlarını doğrulamak için farelerin bir keşif görünümü görüntüsünü alın (200 mm FOV kullanın) ve gerekirse arayüzdeki FOV kutusunu sürükleyerek konumu ayarlayın. CT taramasını başlatmak için tarayıcı yazılımında "İş Akışını Başlat"a tıklayın ve izleyici enjeksiyonundan önce PET taramasının manuel olarak başlatılabilmesi için "etkileşimli kullanıcı istemlerini görüntüle"yi seçtiğinizden emin olun.
5. [11C]DPA-713 Doz Hazırlama
- {{}}11C]DPA-713, laboratuvar önlüğü, eldivenler ve kişisel parmak ve vücut dozimetreleri dahil olmak üzere radyoaktiviteyi ele almak için uygun KKD (kişisel koruyucu ekipman) giydiğinizden emin olun. Radyoaktif kirlenmeyi önlemek için eldivenleri düzenli olarak değiştirdiğinizden emin olun ve mümkünse radyoaktif kaynakla olan mesafenizi artırın.
- Radiotracer şişesini bir kurşun kalkanın arkasına dikkatlice aktarmak için forseps kullanın.
- 60 dakikalık dinamik PET taraması için yeterli bir dozu sağlamak için 100-200 μL hacimde yaklaşık 250-350 μCi / 9-13 MBq içeren her fare için 0.5 mL doz şırıngaları hazırlayın (uygulanan doz, izotopun yarı ömrü ve çalışma tasarımının zaman çizgisi dikkate alınarak, hacim fare ağırlığına bağlı olarak belirlenmelidir).
- Kanülasyon bölgesine yakın bir yerde bulunan C-11'e ayarlanmış bir doz kalibratörü kullanarak aktiviteyi ölçün ve çürüme düzeltmesini sağlamak için ölçüm ve enjeksiyon sürelerini kaydedin. Çürümeyi sınırlamak ve her fareye istenen radyoaktivite seviyesinin enjekte edilmesini sağlamak için BT bitmeden hemen önce dozları hazırlayın.
- Aktiviteyi ölçmeden ve her fareye enjekte etmeden önce doz şırıngasında hava kabarcığı olmadığını doğrulayın.
6. PET Edinimi
- {{}}Fareler otomatik olarak CT'den PET'e ilerlediğinde, tarayıcının arkasını [11C]DPA-713 enjeksiyonu (Şekil 1C). Koruyucu emici dolguyu bir çıkıntıya yerleştirin ve makas ve çakmağın elinizin altında olduğundan emin olun.
- Mühürlü kateter tüpünü makasla kesin, kateter hatlarında herhangi bir kabarcık olmadığını kontrol edin ve 10-20 μL'lik bir tuzlu su yıkama yaparak kanülün hala damar içinde olduğunu onaylayın. Adım 5.4'ten ölçülen doz şırıngalarını 4 kateterin her birine yükleyin ve her fareye hangi dozun verildiğini takip edin.
- PET taraması başlamaya hazır olduğunda ve aynı anda 10 saniyelik bir zamanlayıcı başlatırken "Tamam"a tıklayın. Zamanlayıcı sıfıra ulaştığında 4 fareyi de aynı anda enjekte etmek için tarayıcının arkasında doz şırıngaları ile iki araştırmacı bulundurun. Her kateteri 50-100 μL salin ile yıkayın (kateter tüpünün uzunluğuna bağlı olarak — yani, ölü hacim) tam dozun kuyruk damarına girdiğinden emin olun ve bir çakmak kullanarak tüpü bir kez daha kapatın.
- Artık bir radyoaktivite değeri elde etmek için bir doz kalibratörü kullanarak doz şırıngalarını ölçün (şırıngada kalan herhangi bir izleyici). Değerleri ve kaydedildikleri zamanı not edin.
- Tarama tamamlandıktan sonra, hareket kontrol panelindeki yatay "ana sayfa" düğmesini kullanarak PET yatağını orijinal konumuna getirin. Fareleri tarayıcıdan çıkarın ve kateteri dikkatlice çıkarın. Aşırı kanamayı önlemek için kanülasyon bölgesine hafifçe baskı uygulayın.
- Bir doz kalibratörü kullanarak kateterdeki kalıntı aktiviteyi ölçün.
- Fareler kurtarılacaksa, bunun sıcak bir ortamda yapıldığından emin olun (örn., , altında ısıtılmış ped bulunan veya ılık suyla dolu bir eldiven içeren bir kutuda). Fareleri ötenazi yapmayı planlıyorsanız, fareleri izofluran içeren bir indüksiyon odasına yerleştirin, böylece perfüzyon yoluyla ötenaziden önce anestezi altında kalırlar.
- Verileri yeniden oluşturmak için, lst dosyasından oluşturulan histogram verilerini kullanarak her taramayı otomatik olarak yeniden oluşturacak olan işlem sonrası yönetim yazılımını açın (bkz. Table of Materials).
7. Dinamik PET Görüntü Analizi
1. Görüntü analiz yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve CT görüntüsünü yüklemek için "açık veri" simgesine (kaynak olarak) ve dinamik PET'i yüklemek için "veri ekle" simgesine (referans olarak) tıklayın.
2. Açılır menüdeki zaman serisi operatörü aracılığıyla verilerin görsel kalite kontrolünü gerçekleştirin: Referans ("ref") ve "global"i seçin ve renk ölçeği için uygun bir minimum ve maksimum uygulayın. Dinamik PET verilerini kare kare görselleştirin, radyoaktivite alımını doğrulayın ve tarama içinde herhangi bir hareket karışıklığı olup olmadığını kontrol edin.
3. "Aritmetik operatörü" kullanarak ortalama bir PET görüntüsü oluşturun.
1. "Ortalama seçilen"i seçin, "ref"in işaretini kaldırın ve tüm PET çerçevelerinin ortalamasını oluşturmak için giriş 1'in ("Inp1"), giriş 2'nin ("Inp2") ve giriş yıldızının ("Inp*"-taramadaki PET çerçevelerinin geri kalanını içerir) seçili olduğundan emin olun.
2. "Veri yöneticisi" sekmesine (DM) gidin ve görselleştirme amacıyla ortalama görüntüyü "input1" konumuna sürükleyin. "Min-max" aracındaki otomatik hesaplamaya tıklayarak renk ölçeğini yeniden dağıtın.
4. "Yeniden yönlendirme/kayıt" açılır menüsündeki "otomatik 3D" işlevini kullanarak CT'yi ortalama PET dosyasına kaydedin.
1. "Ref" ve "Inp1" i seçin ve "sert", "hızlı", "Inp1'den Ref'e" kaydını seçin. 3 boyutun tümünde kaydı görsel olarak kontrol edin ve gerekirse "çevirme" ve "döndürme" işlevlerini kullanarak "manuel 3D" sekmesinde manuel olarak ayarlayın.
2. Kayıttan memnun kaldığınızda, "Inp2" ve "Inp*" öğesini seçin ve onay işaretine tıklayarak tüm PET çerçevelerine uygulayın. DM'deki CT ve PET dosyalarına sağ tıklayın ve ham olarak kaydedin.
5. BT'yi kılavuz olarak kullanarak beyin analizi için her seferinde bir farenin beynini kırpın: Açılır menüden "kırpma"yı seçin ve farenin kafasını beyin sapının altına kırpmak için görüntü sınırlarını sürükleyin. Kafatasının tüm boyutlarda düz olması için yukarıda açıklandığı gibi "manuel 3D yeniden yönlendirme" işlevini kullanarak PET ve CT görüntülerini yeniden yönlendirin.
6. Arayüzün sol üst köşesindeki "veri ekle" düğmesini kullanarak bu fare için MR görüntüsünü (DICOM formatında) yükleyin. "Manuel 3D yeniden yönlendirme" kullanarak MR'yi hareket ettirin ve BT görüntüsünde kafatasına sığdırın (tüm modalitelerin aynı yönde olduğundan emin olun).
7. "3D ROI aracını" kullanarak MR görüntüsüne kontur ROI'sini çizin.
1. Görsel denetleyici sekmesinde (VC) seçimini kaldırarak PET görselleştirmesini kapatın ve ROI'yi çizmek için yalnızca MR ve CT'yi kullanın.
2. Yeni bir yatırım getirisi oluşturmak ve "enfarktüs" olarak adlandırmak için "ROI ekle" düğmesine tıklayın. "Spline aracını" seçin, ROI kenarlığını çizmek için sol tıklayın ve kapatmak için sağ tıklayın.
3. En iyi uygulama, kafatası kenarlığı ile vuruş ROI'si arasında bir voksel boşluğu bırakmak olmak üzere, ROI'deki kafatasının hiçbirini yakalamadığınızdan emin olarak, vuruşu kapsayan tüm dilimleri tekrarlayın.
8. Enfarktüs hacmini kullanarak kontrendoral bir yatırım getirisi oluşturun.
1. Yeni bir yatırım getirisi oluşturun ve bunu "karşı taraflı" olarak etiketleyin. Enfarktüs ROI'ye sağ tıklayın ve "dışa aktar"ı seçin. ROI'yi 2 konumuna ("Inp1") sürükleyin.
2. Yalnızca "Inp1" seçiliyken, "yeniden yönlendirme/kayıt" menüsündeki "operatör" işlevini kullanarak sola sağa çevirme uygulayın. "ROI" kutusunu işaretleyin, "yalnızca görüntüle"yi seçin ve yeni ROI'yi karşı taraftaki aynı bölgeye manuel olarak taşıyın. "Aritmetik" operatörünü seçin ve yeni ROI'ye 2'nin skaler çarpımını uygulayın, böylece ROI'lerin bağımsız olarak nicelleştirilmesine izin verin.
3. 3D ROI aracına geri dönün. "Uzman ve deneysel" sekmesine gidin ve "ROI'yi içe aktar" düğmesine tıklayın. Yeni birimi kontralateral ROI olarak yüklemek için iletişim kutusundan Inp1'i seçin.
9. Ortalama PET görüntüsüne sağ tıklayın ve boşaltın ve PET'i tekrar açın. 3D ROI aracındaki "sonuçları dışa aktar" simgesini kullanarak nicel alım sonuçlarını oluşturun.
10. İstenirse ek bölünmüş beyin analizi yapın (yani, Vivoquant yazılımı için bir 3D fare beyin atlası eklenti modülü kullanarak sağ ve sol beyin yarımküre bölgelerinin otomatik ROI üretimi).
1. Kayıtlı PET/CT görüntülerini yeniden yükleyin.
2. "Gelişmiş modüller" menüsüne tıklayarak ve 3B beyin atlası aracını seçerek fare beyin atlasını içe aktarın. "Gelişmiş ayarlar"da "tüm bölgeler sol/sağ"ı seçin ve 3D atlası içe aktarmak için "çalıştır"a tıklayın.
3. Kafatasını sınır olarak kullanarak atlası beynin içine manuel olarak yerleştirin.
4. 14 sol ve sağ hemisfer ROI'sinin tümü (medulla, beyincik, orta beyin, pons, korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, striatum, pallidum, koku soğanları, korpus kallozum ve beyaz cevher) için bir sonuç tablosu oluşturmak üzere "3D ROI'yi içe aktar" seçeneğinin işaretli olduğundan emin olarak atlası yeniden çalıştırın.
11. Tarayıcı işletim yazılımını kullanarak dalaktaki izleyici alımını ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
1. PET ve CT görüntü dosyalarını veritabanında vurgulayarak ve "genel analiz"e tıklayarak yükleyin.
2. Kayıt sekmesine tıklayın ve "sert kayıt" simgesine tıklayarak PET ve CT görüntülerini birlikte kaydedin.
3. ROI niceleme sekmesine tıklayın, "ROI oluştur" simgesine tıklayın ve dalak olarak adlandırın.
4. Referans olarak CT dosyasını kullanarak dalak ROI'lerini çizmek için "küre" aracını seçin ve böbrek alımıyla örtüşme olmadığından emin olun (böbreklerden yayılmayı önlemek için PET görüntüsünü ve sinyalini kullanarak).
5. Hayvanlar arasında tutarlı yatırım getirisi hacimlerini korumak için yatırım getirilerini düzenleyin.
12. Alım normalizasyonu için standart bir düzeltme değeri hesaplayın.
1. PET / CT verilerini standart taramadan yükleyin ve "manuel 3D ROI" aracını kullanarak 20 mL şırıngayı kapsayan bir silindir ROI oluşturun.
2. Elektronik tablo simgesini kullanarak standartta yer alan radyoaktivite seviyesini elde edin.
3. PET alım değerleri için bir düzeltme faktörü oluşturmak için bu nCi / cc sonucunu ve standart için orijinal kaydedilen radyoaktiviteyi (yani, standardın nCi / cc cinsinden doz kalibratörü ölçümü) kullanın. Yani, doz kalibratörü tarafından kaydedilen standardın radyoaktivitesini, standardın PET görüntüsünden hesaplanan radyoaktiviteye bölün.
13. Tüm fareler için PET edinme zamanına doğru şekilde bozunmak için doz aktivitelerini ve ölçüm zamanını kullanın (yani, PET taramasının başlangıcındaki doz aktivitesini hesaplayın).
14. Kalıntı değerler için tekrarlayın ve her bir hayvanın aldığı tam aktiviteyi hesaplamak için çürüme düzeltilmiş dozdan çıkarın.
15. Bu bozulma düzeltmesini uyguladıktan sonra, verilerin doğru aktivite seviyesinde olduğundan emin olmak için standart düzeltmeyi de uygulayın. Bu düzeltmelerin manuel olarak çizilen ROI sonuçlarına ve beyin atlası ROI verilerine dMCAO konumu (yani korteks, hipokampus ve striatum) için ilgili beyin bölgelerine uygulandığından emin olun.
16. Aşağıdaki denklemi kullanarak tüm ROI'ler için %ID/g'yi hesaplayın: %ID/g = (nCi/cc cinsinden ROI radyoaktivitesi / nCi/cc'de alınan bozunma düzeltilmiş doz) x100. Her ROI için zaman etkinliği eğrileri oluşturmak için grafik yazılımını kullanarak %ID/g'yi zamanın bir fonksiyonu olarak çizin.
17. Son görüntü görselleştirme ve şekil oluşturma için tarayıcı yazılımını kullanın. Görüntüleri, tarama sırasında her fare tarafından alınan bozulma düzeltilmiş doza göre normalleştirin ve tüm görüntülerin aynı %ID/g ölçeğinde olduğundan emin olun.
NOT: Bu, farklı farelerden alınan görüntülerin ve/veya farklı günlerde gerçekleştirilen çalışmalardan alınan görüntülerin doğru bir şekilde karşılaştırılmasını sağlamak için gereklidir.