Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyninden İzole Edilen Polizomların Görüntülenmesi

Abstract

Kaynak: Lunelli, L., et. al. Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polizomlarına Bakış. J. Vis. Exp.(2016).

Bu video, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak polizomların görüntülenmesini göstermektedir. Nikel iyonları kaplı bir mika levhası, RNA'yı bağlı ribozomlarla sabitler. Numune yıkanır, kurutulur ve mikroskop tablasına monte edilir. Konsol ucu, topolojiyi haritalamak için lazer sapmalarını kaydederek numune yüzeyini tarar. Yazılım, bozulmaları düzeltmek ve yüksek çözünürlüklü polizom yapılarını görselleştirmek için kullanılır.

Protocol

Dikkat: Numunelerde herhangi bir RNA bozulmasını önlemek için, RNaz kontaminasyonunu en aza indirmek için tüm tamponları DEPC ile arıtılmış su kullanarak hazırlayın.

1. Tüm Beyinlerden Polizomların Hazırlanması

1. Beyin dokularının toplanması (15 dk)
   1. {{}}{{}}₂ 5 dakika boyunca boğulma. Beyni kafatasından dikkatlice çıkarın, dokuyu 1.5 ml'lik bir tüpe yerleştirin ve hemen sıvı nitrojen içine yerleştirin. Kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
2. Lizat hazırlanması (30 dk)
   1. Sıvı nitrojen altında havan ve havan tokmağı kullanarak tüm beyin dokusunu toz haline getirin.
   2. Yaklaşık 25 mg tozu soğuk bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hemen (toz haline getirilmiş dokunun çözülmesini önlemek için) 0.8 ml Lizis Tamponu ekleyin (Tablo 1) ve 25 kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreyi bozun.
   3. Hücresel kalıntıları topaklamak için tüpü 12.000 x g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 15 dakika buz üzerinde tutun.
   5. Tüpü 12.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca pelet çekirdeklerine ve mitokondriye santrifüjleyin.
   6. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   7. Süpernatanı –80 °C'de en fazla 6 ay saklayın veya hemen kullanın.
3. Sükroz gradyan hazırlama ve santrifüjleme (2 saat 30 dakika)
   1. {{}}₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O çözüm.
   2. Tüpleri buzun üzerine koyun ve her tüpün dibine 5,5 ml soğuk %50 sükroz çözeltisi ekleyin (sükroz çözeltileri için Tablo 1'ye bakın). Tüp tamamen dolana kadar keskin bir ara fazı korumak için ara faza yakın kalarak %15'lik sükroz çözeltisini damla damla dikkatlice ekleyin. Tüp tamamen dolduğunda, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için lastik bir tıpa ile kapatın.
   3. Soğuk bir odada, tüpleri nazikçe yatay olarak yatırın ve 2 saat bu pozisyonda tutun. Bu sürenin sonunda, tüpleri yavaşça dikey konuma getirin ve buzun üzerine koyun. Degradeler artık kullanıma hazırdır. Alternatif olarak, geleneksel bir gradyan oluşturucu kullanarak %15-50 sükroz gradyanını hazırlayın.
   4. Soğuk bir odada, gradyanın üstünden 1.0 ml'yi dikkatlice çıkarın ve sakarozun sitozolik lizat (yani, adım 1.2'de elde edilen süpernatant) ile damla damla kaplayın.
   5. Tüpleri dikkatlice sallanan kova rotorunun kovalarına indirin. Bir ultrasantrifüj kullanarak gradyanları 180.000 x g'de 4 °C'de 100 dakika santrifüjleyin.
   6. Santrifüjlemeden sonra, gradyanları stabilize etmek için tüpleri 4 °C'de 20 dakika kovalarında bırakın.
4. Sükroz gradyan fraksiyonasyonu (2 saat)
   1. Ultrasantrifüj rotorundan bir ultrasantrifüj tüpünü dikkatlice çıkarın ve bir Yoğunluk Gradyan Fraksiyonlama Sisteminin toplayıcı cihazına monte edin. Bir UV/VIS dedektörü ile 260 nm'de absorbansı izlemek için 1 ml fraksiyonları toplayın (Bkz. Şekil 1 üst panel). Toplanan fraksiyonları buz üzerinde tutun.
   2. İlgilenilen fraksiyonların 30-40 μl'lik alikotlarını hazırlayın. Kullanana kadar -80 °C'de saklamadan önce buz üzerinde tutun. İkiden fazla donma-çözülme döngüsünden geçmiş alikotları veya sükroz fraksiyonlarını kullanmayın (bkz. Şekil 1 alt panel).

2. Atomik Kuvvet Mikroskobu için Numune Hazırlama (3 saat)

1. Bant kullanarak mika tabakalarını soyun.
2. Mika tabakalarını 3-4 kez DEPC suyu ile yıkayın ve küçük bir Petri kabına koyun. Ardından yüzeyi hava kullanarak kurulayın.
3. Mika'yı 200 μl 1 mM NiSO₄ ile örtün ve RT'de 3 dakika inkübe edin.
4. Nikel çözeltisini çıkarın ve ardından yüzeyi hava kullanarak kurutun. Mika ile Petri kabını buzun üzerine yerleştirerek gelecekteki tüm adımları 4 °C'de gerçekleştirin.
5. 1.4.2'de elde edilen bir alikotu buz üzerinde çözdürün ve numunenin tamamını yavaşça damla damla mika'ya ekleyin. 100-200 μl'lik bir uç kullanarak numuneyi mika'nın tüm yüzeyine yayın. Numuneyi buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
6. Mika tabakasını 200 μl soğuk Buffer-AFM ile damla damla örtün (bkz. Tablo 1) ve buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
7. Sıvı içinde görüntüleme
   1. Tampon-Atomik Kuvvet Mikroskobunu (AFM) dikkatlice çıkarın ve fazla sakarozdan kurtulmak için mika tabakalarını 200 μl soğuk Tampon-AFM ile 3-4 kez yıkayın. Daha sonra mika tabakalarını 3 kez soğuk bir Yıkama Solüsyonu ile yıkayın (bkz. Tablo 1), mika yüzeyini birkaç mikrolitre solüsyonla kaplayarak bırakın.
   2. 3. noktaya gidin (Görüntü alma).
8. Havada görüntüleme
   1. Buffer-AFM'yi dikkatlice çıkarın ve fazla sakarozun giderilmesi için mika'yı 200 μl soğuk Buffer-AFM ile 3-4 kez yıkayın. Daha sonra mikaları soğuk yıkama solüsyonu ile 3 kez yıkayın (bkz. Tablo 1) ve fazla suyu kağıt kullanarak boşaltın.
   2. Numuneyi, Petri kabının üst kısmı kısmen açık olacak şekilde kimyasal başlığın altında kurumaya bırakın. 2 saat sonra Petri kabını kapatın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın. Yıllarca stabil oldukları için numuneyi 2-3 saat sonra ölçün.

3. Görüntü Alma (Termal stabilizasyondan sonra görüntü başına 15 dakika)

Not: Mika üzerinde hareketsiz hale getirilen polizomlar, AC modu kullanılarak havada veya sıvı içinde görüntülenebilir.

1. Mika'yı çift taraflı bant kullanarak numune tutucuya takın.
2. Numune tutucuyu AFM aşamasına yerleştirin.tage üreticinin talimatlarını izleyerek. Sıvı içinde görüntüleme yaparken, mümkünse, zaman içinde polizom stabilitesini artırmak için numuneyi 25 °C'den daha düşük bir sıcaklıkta tutmaya çalışın.
3. AC görüntülemeye uygun bir konsol seçin ve üreticinin talimatlarını izleyerek uç tutucuya monte edin. Burada, hava görüntüleme için 2-20 N/m arasında ve sıvı görüntüleme için yaklaşık 0.1 N/m arasında bir kuvvet sabitine sahip konsollar kullanın.
4. Konsol üzerindeki lazer noktasını ayarlayın ve kadran dedektörü sinyallerini sıfırlayın.
5. Uygun bir sürüş frekansı seçin ve konsolu 10-20 nm genlik ile sürün.
6. Uç yüzeye temas edene kadar numuneye yaklaşın.
7. 2x2 μm'lik bir tarama alanı seçin, en az 512x512 piksel görüntüler elde edin (piksel genişliği < 4 nm) ve canlı bir arka plan çıkarma modu ve 20-25 nm'lik bir Z ölçeği seçin.
8. Görüntüyü, havada alındığında 10 ila 15 nm arasında, sıvı içindeyken 25 ila 30 nm arasında yükseklik ve 25-30 nm aralığında genişlik ile karakterize edilen yuvarlak nesnelerin varlığını arayarak inceleyin. Keskin nesneler görselleştirilene kadar ayar noktası ve geri besleme parametrelerini ayarlayın. İyi örneklerde arka plan, 2-4 nm yüksekliğindeki nesnelerle nispeten düz görünmelidir (bkz. Şekil 2A ve B).
9. Görüntü iyi görünüyorsa (madde 3.8'de belirtildiği gibi), farklı numune alanlarında birkaç (en az on) 2x2 mikron tarama yapın.
10. (isteğe bağlı). Gerekirse, seçilen polizomların yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde edin (bkz. Şekil 2C).
11. AFM görüntülerini düzeltmek için yazılım düzeltmeleri (düzlem çıkarma ve satır satır düzeltme algoritmaları) uygulayın, rastgele eğim ve kayma efektlerini kaldırın.

4. Veri Analizi (görüntü başına 30 dakika)

1. Görüntüleri ImageJ'de dışa aktarın (isteğe bağlı: bir ölçek faktörü uygulayın) tercihen kayıpsız bir sıkıştırma formatı kullanarak, örneğin TIFF formatı (bkz. Şekil 3A).
2. Polizomlardaki ribozomları saymak için ImageJ makro araç seti RiboPick.ijm'yi (ImageJ makro/araç seti alt dizinine kopyalanacak) kullanın (bkz. Şekil 3B) ve örneğin istatistiksel özelliklerini hesaplayın (bkz. Şekil 3C).
   1. Programı başlatan aracını kullanarak bir görüntü yüklemeye başlayın.
   2. Standart ImageJ aracıyla ribozom merkezlerini seçin (shift + sol tıklama, ribozomların çoklu seçimine izin verir). Seçilen ribozomları aracıyla işaretleyin. Ribozom koordinatları özel bir metin penceresinde görünecektir.
   3. Aynı polizoma daha fazla ribozom ekleyin, 4.2.2 noktasında belirtilen prosedürü tekrarlayın.
   4. aracını kullanarak yanlış işaretlenmiş ribozomları çıkarın (son eklenen ribozomdan ilkine çıkarmaya başlayın - yalnızca mevcut polizomda).
   5. Polizom tamamlandığında aracını kullanın. Polizom sayısı görüntüye bir kaplama olarak eklendiğinden, metin penceresi güncellenir.
   6. Ribozom koordinatları dosyasını (görüntünün varsayılan birimleri kullanılır) ve seçilen ribozomları ve polizomları özetleyen bir PNG görüntüsünü yazmak için seçeneğini kullanın. Orijinal görüntü kaydedilmeden kapatılır.

Tablo 1. Arabellek.

10 mM Tris–HCl, pH 7.5

Tampon	Kompozisyon
Lysis Buffer	{{}}
	10 mM NaCl	{{TAG_ 577}}
	10 mM MgCl2
	%1 Triton-X100
	1% Na-deoksikolat
	0.4 U/ml RNaz İnhibitörü
{{ TAG_641}}	1 mM DTT
	0.2 mg/ml sikloheksimid
	{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
%50 sükroz çözeltisi{{ }}	%50 (a/h) sükroz	Sükroz Gradyan Hazırlama (1.2)
	100 mM NaCl {{TAG_717 }}
	10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
%15 sükroz çözeltisi	{{ TAG_764}}%15 (a/h) sükroz	Sükroz gradyan hazırlama (1.2)
	100 mM NaCl
10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
Nikel Çözeltisi	1 mM NiSO4	AFM için numune hazırlama (2)
Buffer-AFM	100 mM NaCl	AFM (2)
	10 mM MgCl2
	{{TAG_908 TAG_907}}100 μg/ml sikloheksimid{{}}{{}}100 μg/ml sikloheksimid{{}}
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	%3 (a/h) sükroz pH = 7.4
Yıkama Çözüm	{{}}{{TAG_962 TAG_963}}	AFM için numune hazırlama (2)
	100 μg/ml sikloheksimid {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}{{ TAG_610}}{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}

Results

Materials