$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikro Bilgisayarlı Tomografi (BT) Taramaları için Örnek Hazırlama
- {{}}Karbondioksit boğulması yoluyla P8'deki yenidoğan yavrularına ötenazi yapın.
- Fare kalbinin ventrikülüne 10 mL'lik bir şırınga içinde fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 3 mL% 2 paraformaldehit içeren 29 gauge bir iğne sokarak intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
DİKKAT: Paraformaldehit toksiktir; Uygun koruma kullanın. - Makas kullanarak kafayı vücuttan ayırın. Bir makas kullanarak kafadaki tüm cildi çıkarın ve tüm beyni incelemek için forseps kullanarak kafatasını soyun.
- Stereomikroskop ile 7.82x büyütme, 1x kazanç, 0.6 gama ve 20 ms pozlama süresinde beynin görüntülerini alın.
- Diseke beyinleri gece boyunca PBS çözeltisinde% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
DİKKAT: Paraformaldehit toksiktir; Uygun koruma kullanın. - Ertesi gün, forseps kullanarak arka beyinleri ayırın ve PBS solüsyonu ile yıkayın.
- Arka beyinleri Lugol'un iyot çözeltisinde 48 saat kuluçkaya yatırın.
- İnkübasyonun ardından, fazla Lugol'un iyot çözeltisini çıkarmak için arka beyinleri kısa bir süre havayla kurutun.
- Lugol'un iyot lekeli arka beyinlerini 0,65 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine koyun ve doku büzülmesini önlemek için plastik parafin filmle tamamen kapatın (Şekil 1A).
- Mikrosantrifüj tüplerini, tarama sırasında hareket etmelerini önlemek için süngerli 5 mL'lik plastik tüplere yerleştirin (Şekil 1B).
2. Fare Beynindeki serebral kavernöz malformasyonların (CCM'ler) Mikro-BT Taraması
- {{}}Bir tüp içinde paketlenmiş arka beyni mikro-BT sistemindeki bir alüminyum tutucuya dikey olarak monte edin.
- Tomografik veri kümelerini elde etmek için tarama parametrelerini 540 kV ve 2 W kaynak koşullarıyla 50 projeksiyon ve 10 sn pozlama süresine ayarlayın (görüntü çözünürlüğü 9,5 μm/piksel).
- Taramadan elde edilen radyografiler, mikro-CT sistemi tarafından sağlanan donanım tabanlı projeksiyon rekonstrüksiyon yazılımı tarafından otomatik olarak yeniden oluşturulur ve 16 bitlik eksenel dilimlerden oluşan bir görüntü serisi ("TXM" dosyası) üretilir.
3. Mikro-BT Veri Kümelerinin Analizi
- {{}}Yeniden yapılandırılmış görüntü dosyasını ("TXM" dosyası) 3 boyutlu analiz yazılımında açın ve "hacim oluşturma" işlevini kullanarak beyni görselleştirin.
- "Sınırlayıcı kutu" ve "kırpma düzlemi" işlevlerini kullanarak arka beyni istenen yöne dönüştürün.
- Dönüştürülen görüntüyü genişletilmiş modda yeniden örnekleyin ve voksel boyutunu koruyun.
- Dönüştürülen görüntüde (3.3) "yeni etiket alanını düzenle" oluşturun ve gri tonlama yoğunluğunu kullanarak yalnızca arka beyni vurgulayın.
- Vurgulanan alanları ekleyin ve tüm arka beynin ölçümlerini elde etmek için "etiket analizi" yapın (, yani , toplam hacim ve alan). Ölçümleri bir Excel dosyasında dışa aktarın.
- "İzoyüzey oluşturma" işlevini kullanarak arka beyni görselleştirin.
- Dönüştürülen görüntüde başka bir "yeni etiket alanını düzenle" oluşturun ve gri tonlama yoğunluğunu kullanarak lezyonları olan alanları vurgulayın.
- Vurgulanan alanları ekleyin ve arka beyindeki lezyonların ölçümlerini elde etmek için "etiket" analizi yapın (}, yani , toplam hacim ve alan). Ölçümleri bir Excel dosyasında dışa aktarın.
- "Yüzey oluştur" ve "yüzey görünümü" fonksiyonlarını kullanarak lezyonları görselleştirin.
- Arka beynin görüntülerini istenen yönlerde anlık görüntü alın veya lezyonların 3 boyutlu görselleştirilmesi için bir film oluşturun.
