Farklılaşmış Oligodendrositleri Tanımlamak için Çift Floresan Görüntüleme

Özet

Kaynak: Schott, J. T., {{}} ve diğerleri. Sıçan Oligodendrosit Progenitör Kültürlerinin Hazırlanması ve Çift Kızılötesi Floresan Taraması Kullanılarak Oligodendrogenezin Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, bir sıçan yavrusu beyninden izole edilen öncü hücrelerden (OPC'ler) oligodendrositlerin farklılaşmasını değerlendirmek için ikili floresan görüntülemenin kullanımını göstermektedir. İşlem, hücrelerin sabitlenmesini, spesifik belirteçlerin birincil ve florofor konjuge ikincil antikorlarla etiketlenmesini ve bunların floresan görüntüleme kullanılarak görselleştirilmesini içerir. Hem miyelin bazik proteinini (MBP) hem de oligodendrosit transkripsiyon faktörü 2'yi (Olig2) eksprese eden farklılaşmış oligodendrositler tanımlanır ve bunları sadece Olig2 eksprese eden farklılaşmamış öncü hücrelerden ayırır.

Protokol

1. Tahlil Plakalarının, Stok Çözeltilerinin ve OPC Baz Ortamının Hazırlanması

Not:<span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' > Burada açıklanan sıçan OPC baz (Sato) ortamı daha önce yayınlanmış çalışmalardan türetilmiştir. Alternatif besiyeri formülasyonları da bu prosedürle uyumlu olabilir.

1. Poli-L-lizini (PLL) steril deiyonize suda 10 μg/ml konsantrasyona yeniden süspanse edin. Seyreltilmiş PLL'den 400 μl'yi siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 24 kuyulu doku kültürü dereceli bir kabın her bir oyuğuna pipetleyin.
2. Doku kültürü kaplarını 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatöründe 2 saat veya gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında kaplayın.
3. Kaplamadan en az 20 dakika önce kaplanmış bulaşıklardan PLL'yi aspire edin. Kapak kısmen aralık kalacak şekilde 24 oyuklu plakayı bir doku kültürü başlığına yerleştirerek kalan PLL'nin kuyudan kurumasını bekleyin. İzole OPC'leri kaplamadan önce kuyuların tamamen kuru olduğunu doğrulayın. Hücreler, sıvı PLL bulunan plastiğe yapışmaz.
4. Prepare N-Asetil-L-sistein (NAC) stok çözeltisi (1.000x): 100 mg çözünN-Asetil-L-sistein (NAC) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium'unun (DMEM) 20 ml'sinde. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
5. Hidrokortizon stok çözeltisini hazırlayın (1.000x): 1 mg Hidrokortizona 1 ml etanol ekleyin ve çözünmesi için döndürün. 19 ml DMEM ekleyin, çözeltiyi karıştırın, alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın. Baz ortama hidrokortizon ilavesinin glial hücrelerin hayatta kalmasını arttırdığı gösterilmiştir.
6. D-Biotin stok çözeltisini hazırlayın (5.000x): 2.5 mg d-biotin'i 50 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün. Çözünmeye yardımcı olmak için 1-2 x 5 μl damla 0.1 N NaOH ekleyin. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
7. İnsülin stok çözeltisini hazırlayın (100x): 25 mg İnsülini 50 ml doku kültürü dereceli suda çözün. 250 μl 1 N HCl ekleyin ve çözelti berraklaşana kadar karıştırın. 0,22 μm'lik bir filtre ile sterilize edin ve 4 °C'de 6 haftaya kadar saklayın.
8. Sato stok çözümünü hazırlayın (100x):
   1. Progesteron stok solüsyonu hazırlayın (25 μg/μl): 2,5 mg progesteronu 100 μl etanol içinde çözün.
   2. Sodyum selenit stok çözeltisi (400 ng/μl) hazırlayın: 4 mg sodyum seleniti 100 μl 0.1 N NaOH içinde çözün. 10 ml DMEM ekleyin ve karıştırın.
   3. 100 ml DMEM'e 1 g insan apo-Transferrin, 1 g sığır serum albümini ve 160 mg putresin ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın. 25 μl progesteron stok çözeltisi, 1.000 μl sodyum selenit stok çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
9. OPC Baz Ortamını Hazırlayın: 100 ml DMEM başına (4.5 g / L D-glikoz, L-glutamin ve 110 mg / L sodyum piruvat ile), 100 μl NAC, 100 μl hidrokortizon, 20 μl d-Biotin, 1 ml insülin, 1 ml Sato stoğu, 100 μl eser element B, 2 mL B-27 takviyesi (50x) ve 1 ml penisilin / streptomisin (100x). 0,22 μm filtre ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
10. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü AA (PDGF-AA) stok çözeltisini (1.000x) hazırlayın: 20 μg / ml'lik bir çözelti yapmak için% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ile 12.5 ml PBS içinde 250 μg çözün. Aliquot ve -80 °C'de saklayın.
11. OPC proliferasyon ortamını hazırlayın: 20 ng / ml PDGF-AA ile desteklenmiş OPC baz ortamı.
12. OPC farklılaşma ortamını hazırlayın: 45 nM triiyodotironin ile desteklenmiş OPC baz ortamı.
13. Kolon Tamponu Hazırlayın: 500 ml PBS'ye 2,5 g BSA ve 2 ml 0,5 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve pH'ı 7,2'ye ayarlayın. 0,22 μm filtre ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.

2. %4 ile OPC Farklılaşması ve Fiksasyonunun İndüksiyonu Paraformaldehit

Not:<span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' > Küçük moleküllerin oligodendrogenez üzerindeki etkisini test ederken, daha sonra -80 ° C'de saklanabilen ve % 0.1'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için doğrudan SATO ortamına seyreltilebilen 1.000x stok hazırlamak için ilaçları rutin olarak dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözeriz. Bu DMSO konsantrasyonunu kullanarak OPC proliferasyonunda veya farklılaşmasında herhangi bir değişiklik gözlemlemedik (veriler gösterilmemiştir).

1. OPC baz ortamını 37 °C'ye ısıtın ve ilaç tedavi stoklarını oda sıcaklığında çözün. Tedavileri iki parça halinde gerçekleştirirken, 1.5 ml'lik bir tüpte tedavi grubu başına yaklaşık 1.25 ml ortam hazırlayın. Üçlü numuneler için, gevşekliği hesaba katmak için 2 ml kapasiteli santrifüj tüpleri kullanın.
2. Arıtma stoklarını doğrudan OPC baz ortamına seyrelterek replikasyon kuyuları için arıtma ana karışımlarını hazırlayın. İşlemin homojen dağılımını sağlamak için her bir mastermix'i kısaca girdaplayın veya hafifçe karıştırın.
3. 45 nM triiyodotironin hazırlayın (T₃) pozitif kontrol ve negatif kontrol olarak uygun araç. 10 mM seyreltme T₃, 1 ml OPC baz ortamında 1: 1.000 oranında stoklayın ve ardından gerekirse DMSO'nun nihai konsantrasyonunu azaltmak için arıtma ana karışımında daha fazla seyreltin.
4. Hücrelerin kurumasını önlemek için ortamı kültür kuyularından her seferinde bir tedavi grubundan aspire edin. Kuyu kenarlarından siyah malzemenin kültüre kazınmasını önlemek için cam Pasteur pipetinin ucunda 200 μl'lik bir pipet ucu kullanın.
5. 1 ml'lik bir pipet kullanarak kuyu kenarına 500 μl tedavi mastermix'i yavaşça ekleyin.
6. Kültürleri istenen zaman dilimi için inkübe edin, her 2-3 günde bir taze tedavi ortamı ile tam bir ortam alışverişi gerçekleştirin. Rutin olarak %30-40 MBP⁺4 gün sonra kültür farklılaşma ortamı.
7. İstenen tedavi süresinin sonunda, taze% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın veya donmuş bir stoğu oda sıcaklığına çözün. CAUTION: PFA son derece toksiktir ve çeker ocakta hazırlanmalıdır.
8. Ortamı aspire edin ve hücreleri sabitlemek için kuyu tarafına yavaşça 400 μl PFA ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
9. PFA'yı aspire edin ve yavaşça 500 μl steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini ekleyin (D-PBS, Ca²⁺ ve Mg²⁺) hücreleri yıkamak için kuyu tarafına. Yıkamayı toplam iki kez daha tekrarlayın. Son yıkamayı aspire etmeyin.
10. Plakayı parafilme sarın ve daha sonra işlenmek üzere 4 °C'de saklayın veya doğrudan bir sonraki adıma geçin. Plakalar birkaç hafta saklanabilir.

3. Miyelin Temel Proteininin İmmünositokimyası ve Miktar Tayini

Not:<span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' > 24 kuyulu plaka üzerinde sıvı işleme prosedürleri gerçekleştirirken, hücrelerin kurumasını önlemek için hızlı çalışılması önerilir. Burada çok kanallı vakum aspiratörü ve çok kanallı pipet kullanılması tavsiye edilir.

1. Plakayı oda sıcaklığına getirin, kuyucukları aspire edin ve 250 μl D-PBS ekleyin (Ca²⁺ and Mg²⁺) %0.1 Triton X-100 ve %5 normal keçi serumu (NGS) içerir. Plakayı hafif yörünge çalkalaması ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
2. Fare monoklonal anti-MBP antikoru 1:1.000 ve tavşan poliklonal anti-Aktin antikoru 1:200'ü D-PBS'de seyrelterek birincil inkübasyon solüsyonunu hazırlayın (Ca²⁺ and Mg²⁺) %5 NGS içerir. Alternatif olarak, 1: 1.000'de tavşan poliklonal anti-Olig2, karışık glial kültürlerde oligodendrosit spesifik normalizasyon için kullanılabilir. Kuyu başına 250 μl'yi barındıracak kadar birincil çözelti hazırlayın.
3. Primer antikorları gece boyunca 4 ° C'de 16-18 saat boyunca hafif orbital çalkalama ile inkübe edin.
4. Birincil inkübasyon solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 500 μl D-PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın (Ca²⁺ ve Mg²⁺) oda sıcaklığında hafif orbital sallama ile.
5. Plakayı yıkarken, anti-mouse 680 ve anti-rabbit 800 antikorlarını D-PBS'de 1:500 oranında seyrelterek ikincil inkübasyon solüsyonunu hazırlayın (Ca²⁺ and Mg²⁺) %5 NGS içerir. Bu çözümü hazırlarken ortam ışığına maruz kalmayı en aza indirin.
6. Son yıkamayı aspire edin ve 250 μl ikincil inkübasyon solüsyonu ekleyin. Plakayı ışıktan koruyun ve hafif yörünge sallama ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
7. İkincil inkübasyon solüsyonunu aspire edin ve kuyuları 3 x 10 dakika 500 μl D-PBS ile yıkayın (Ca²⁺ ve Mg²⁺) oda sıcaklığında hafif orbital sallama ile.
8. 700 nm ve 800 nm floresan emisyonlarını tespit edebilen bir görüntüleme sistemi kullanarak plakayı tarayın. Başlangıç noktası olarak, odak ofsetini 3'e ve hassasiyetleri MBP için 1,5'e, Actin için 5,0'a ve Olig2 için 3,5'e ayarlayın. Sinyalin aşırı maruz kalmasını önlemek için hassasiyet değerlerini gerektiği gibi ayarlayın.
9. Yarı otomatik yazılım tabanlı yöntemler kullanarak oligodendrogenez derecesini ölçün.
   1. Yazılımı kullanarak, plaka analiz modunu "24 Kuyu" olarak ayarlayın ve taranan kuyucukların dış çevresi etrafındaki daireleri hizalayın. Normalleştirme kanalını "800" olarak ayarlayın ve 700 nm (MBP) ve 800 nm (Olig2/Actin) kanalları için toplam ve bağıl floresan yoğunluklarını dışa aktarın.
   2. Bağıl floresan birimlerinde normalleştirilmiş MBP ifadesini vermek için 700 nm'deki yoğunluğu 800 nm'deki yoğunluğa bölün. Yinelenen ölçümlerin ortalamasını hesaplayın ve ifadeyi analiz için gerektiği şekilde Gün 0 +PDGF denetimlerine ölçeklendirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
Triiodotironine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarat salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Ketiapin hemifumarat tuzu	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-asetil sistein	sigma-aldrich	A9165	5 μg/mL
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/mL
Sodyum Selenit	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/mL
Hydrocortidone	sigma-aldrich	H0135	50 ng/mL<
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/mL<
Insulin<	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1 x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1 x
24 kuyulu kapaklı Siyah Görünür	Perkin Elmer	1450-605	Doku kültürü grade
İmmünositokimya ve Kantitifikasyon
PFA	sigma-aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoklonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 Seyreltme
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
tavşan poliklonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1000 Dilution
keçi anti-fare 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
keçi anti-tavşan 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 keçi anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:000 dilution
Alexa Fluor 488 keçi anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:000 seyreltme
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor

tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-Aldrich