İntraepidermal Sinir Lifleri İçinde Mitokondrinin Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Hamid, H. S., et al. İnsan İntraepidermal Sinir Liflerinde Mitokondrinin Üç Boyutlu Görüntülenmesi ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, üç boyutlu görüntüleme kullanarak sinire özgü mitokondriyi görselleştirme yöntemini göstermektedir. Önceden etiketlenmiş intraepidermal sinir liflerinin sıralı taramalarını elde etme ve sinir yapılarıyla ilişkili olarak mitokondriyi izole etmek ve görüntülemek için 3D yüzey görüntüleri oluşturma sürecini ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Konfokal Görüntüleme

1. 1. Ters çevrilmiş bir mikroskopta 40X yağa daldırma (1.25 sayısal açıklık (N.A.)) objektifli bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri toplayın.
      1. Her odak düzleminde, sırayla floresan sinyalleri alın:
         Çekirdekler: uyarma λ = 405 nm, spektral emisyon filtresi λ = 420 - 480 nm
         Sinir lifleri: uyarma λ= 488 nm, spektral emisyon filtresi λ = 505 - 560 nm
         Mitokondri: uyarma λ = 543 nm, spektral emisyon filtresi λ= 606 - 670 nm
   2. Aşağıdaki tarama parametrelerini mikroskop yazılımına girin: 2 kare ortalaması ve 2,2 yakınlaştırma ile 600 Hz tarama hızı; 12 bit yoğunluk çözünürlüğü (4096 gri seviyesi).
      1. Mikroskop yazılımını optimize edilmiş yanal çözünürlük (tarama çözünürlüğü = 1.024 x 1.024) ve eksenel çözünürlük/optik kesitleme (konfokal açıklık = 1 nm z adım boyutuna sahip 210 havadar birim (AU)) için ayarlayın.
         NOT: Elde edilen XYZ çözünürlüğü 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm'dir ve görüntü boyutu 176,1 μm x 176,1 μm x 30-50 μm'dir.
   3. {{}}Sinir sinyali (yeşil floresan) için canlı bir taramayı etkinleştirin ve Doku kesiti içindeki sinir sinyalini kapsayan mikroskop yazılımında üst ve alt odak düzlemlerini bulmak ve ayarlamak için Z-Focus kontrolü. Toplam z aralığı, 50 μm'lik bir doku kesiti için tipik olarak 30-50 μm'dir.
   4. Canlı bir tarama sırasında tarama alanını mikroskop yazılımıyla döndürün, böylece epidermisis görüntüde yatay veya dikey olarak konumlandırılır.
   5. Her sinyali ayrı ayrı tarayın ve aşırı ve yetersiz doymuş pikselleri en aza indirmek/kaldırmak için dedektör (fotoçoğaltıcı tüp, PMT) voltajını ve ofsetini ayarlayın.
      NOT: Yukarıdaki parametrelerle tarama süreleri, z dilimlerinin sayısına bağlı olarak yaklaşık 20 - 40 dakika sürer.

2. 3D İnsan İntraepidermal Sinir Lifleri İçindeki Mitokondrinin Görselleştirilmesi ve Analizi

1. 3D epidermisi izole edin:
   1. {{}}{{}}{{}}{{}}{{}}{{}}{{}}{{}}{{}}{{}}{{}} Orijinal görüntüyü çoğaltın ve epidermisi tanımlamak ve izole etmek için görüntünün maksimum yoğunluk projeksiyonunu (genişletilmiş odak görünümü) kullanın.
   2. İntraepidermal sinir liflerinde bulunmayan stratum corneum ve dermis gibi istenmeyen alanları çıkarmak için epidermisin üst ve alt kenarları boyunca izlemek için bir ilgi alanı aracı kullanın. Bu seçime göre kırpın.
2. Sinir ve mitokondriyal floresan sinyallerde dekonvolüsyon kullanın:
   NOT: Dekonvolüsyon, floresan sinyallerinin bütünlüğünü geri kazanmaya yardımcı olur. Bu protokolde kullanılan restorasyon, sinyallerin orijinal kaynaklarından ne kadar yayıldığını belirlemek için görüntülerdeki floresan sinyalleri kullandığı için kör dekonvolüsyon olarak adlandırılır (nokta yayılma işlevi). İşlem, sinyal yayılımını başlangıç konumuna geri atayarak sinyal çözünürlüğünü iyileştirir.
   1. Aşağıdaki parametrelerle yeşil floresan sinir sinyali (yeşil floresan) için bir nokta yayılma fonksiyonu (PSF) hesaplayın:
      1. Hesaplanan PSF'yi konfokal olarak ayarlayın. Orta kırılma indisini 1.515'e ve sayısal açıklığı 1.25'e ayarlayın. Dedektör iğne deliğini 1 AU'ya ayarlayın. Lazer uyarma dalga boyunu 488 nm'ye ve emisyon dalga boyunu 515 nm'ye ayarlayın.
   2. Aşağıdaki parametrelerle kırmızı floresan mitokondriyal sinyal (kırmızı floresan) için bir PSF hesaplayın:
      1. {{}}Hesaplanan PSF'yi konfokal olarak ayarlayın. Orta kırılma indisini 1.515'e ve sayısal açıklığı 1.25'e ayarlayın. Dedektör iğne deliğini 1 AU'ya ayarlayın. Lazer uyarma dalga boyunu 543 nm'ye ve emisyon dalga boyunu 617 nm'ye ayarlayın.
   3. Sinir ve mitokondri floresan sinyallerini, yukarıda listelenen karşılık gelen PSF'leri ve %100 güven ve 10 döngülük yineleme sınırında ayarlanmış yinelemeli restorasyon özelliğini kullanarak evrişimi giderme yoluyla optimize edin.
3. Sinire özgü yüzeyler oluşturun:
   1. Protein gen ürünü 9.5 (PGP9.5) ile tanımlanan sinirlerin dekonvolvasyonlu yeşil-floresan ikincil etiketlemesinden sinirlerin katı bir yüzeyini yapmak için "yüzey oluştur" aracını kullanın.
   2. "Pürüzsüz" özelliğinin işaretini kaldırın ve arka plan floresansından önemli ölçüde daha parlak olduğu için sinir sinyalinin eşiğini ayarlamak için mutlak yoğunluk özelliğini kullanın.
   3. Arka plan floresansından önemli ölçüde daha parlak olduğu için sinir sinyalinin eşiğini ayarlamak için mutlak yoğunluk özelliğini kullanın. Sinirleri doğru bir şekilde tanımlamak için eşik değerini yeterince düşük ayarlayın.
   4. Boyuta göre küçük, sinir olmayan yüzeyleri filtreleyin.
      NOT: Gerekirse, birden fazla nesneyi vurgulamak için CONTROL tuşunu basılı tutarak ve ardından bunları Delete tuşuyla silerek "Düzenle" sekmesindeki ek sinir dışı yüzeyleri manuel olarak düzenleyin.
4. Sinire özgü floresan mitokondriyal sinyali izole edin:
   1. "Maske Özellikleri" özelliğini görüntülemek için sinir yüzeyinin Düzenle sekmesini seçin. Oluşturulan sinir yüzeyi, bu sinirler içindeki mitokondriyi keratinositlerle ilişkili mitokondriyal sinyallerden izole etmek için kullanılır.
   2. "Tümünü Maskele" düğmesi bir "Maske Kanalı" penceresi açtığında, mitokondriyal sinyal için "Kanal Seçimi" altındaki açılır menüden dekonvolvasyonlu kırmızı floresan sinyali seçin.
   3. "Maskeyi uygulamadan önce kanalı çoğalt" seçeneğine bir onay işareti koymak için kutuyu tıklayın.
   4. Maske Ayarları'nın "Sabit iç/dış" seçeneğinin önündeki radyo düğmesine tıklayın ve "Voksel dış yüzeyini ayarla" seçeneğine bir onay işareti koymak için kutuya tıklayın ve değer için 0.00 yazın. Sinir yüzeyindeki mitokondriyal sinyalleri temsil eden yeni kanalı oluşturmak için Tamam düğmesine tıklayın.
5. Mitokondriye özgü yüzeyler oluşturun:
   1. Sinire özgü mitokondriyal sinyallerin yeni oluşturulan floresan kanalından mitokondrinin katı bir yüzeyini oluşturmak için "yüzey oluştur" aracını kullanın.
   2. "Pürüzsüz" özelliğinin işaretini kaldırın ve eşiği ayarlamak için "arka plan çıkarma" özelliğini seçin. Bu özellik, arka plandan mitokondriyi tanımlamak için mitokondriyal sinyalin etrafındaki yerel kontrastı kullanır.
   3. Mitokondriyi doğru bir şekilde tanımlamak için eşik değerini yeterince düşük ayarlayın. Bu örnekte, 16 bit (65.536) ölçek için alt eşik 2.000 olarak ayarlanmıştır.
   4. Mitokondriyal yüzeyleri boyuta göre filtreleyin. Bu örnekte, voksel sınırı, mümkün olan en düşük sınır olan 1.0 voksel olarak ayarlanmıştır. Gerekirse, birden fazla nesne seçmek için CONTROL tuşunu basılı tutarak ve ardından Sil tuşuyla silerek "Düzenle" sekmesindeki mitokondri olmayan yüzeyleri manuel olarak düzenleyin.
      NOT: Bazen, yazılım ayırt edilebilir bir floresan mitokondriyal sinyalle ilişkili olmayan yüzeyler oluşturacaktır. Bu durumlarda, bunları "Düzenle" sekmesi ile kaldırmak mümkündür.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Leica SP5 lazer taramalı konfokal mikroskop	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
{{}}Volocity x64 yazılımı	Perkin Elmer, Waltham , MA	{{}}Sürüm 4.4.0	{{}}Volocity yazılımı görüntü işleme için kullanılır
Imaris x64 3D analiz yazılımı{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	Sürüm 7.7.1	Imaris yazılımı görüntü analizi için kullanılır