Drosophila Beyninin Nöropeptitlere Tepkilerini İncelemek için Ex Vivo Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Kaynak: Ishimoto, H. et. al., Drosophila'da endokrin sinyalizasyona beyin tepkilerini görselleştirmek için ex vivo kalsiyum görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, çalışmak için kalsiyum görüntülemeyi göstermektedirDrosophila nöropeptitlere beyin tepkileri. Floresan kalsiyum indikatörünü eksprese eden nöronlar, hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve sinyal moleküllerine fonksiyonel tepkileri ortaya çıkarır.

Protokol

1. Larva Beyin Eksplantlarının Hazırlanması

1. Bir görüntüleme odası yapın.
   NOT: Kararlı kayıt, beyin eksplantlarının bağlı olmasını gerektirir. Burada, Ca²⁺ görüntüleme sisteminde düşük maliyetli, el yapımı bir görüntüleme odası kullanılmaktadır.
   1. Forseps kullanarak, larva beyninin ventral ganglionu için bir çukur oluşturmak için plastik bir kültür kabının (35 mm x 10 mm) alt merkezini çizin, böylece montajı kolaylaştırın (adım 1.3, Şekil 1).
   2. Bir kürdan ile, göçüğün her iki tarafına küçük bir damla süper yapıştırıcı yerleştirin ve yapıştırıcıya bir tungsten çubuk (0,125 mm çap, 6 ila 7 mm uzunluk) yapıştırın.
   3. Küçük bir macun benzeri yeniden kullanılabilir yapıştırıcı parçası kullanarak, göçüğü çevreleyen dairesel bir duvar (10 mm çapında ve 3 mm yüksekliğinde) yapın (Şekil 1).
      NOT: Duvarın içindeki boşluk daha sonra fosfat tamponlu tuzlu su ile doldurulacaktır (PBS; 0.14 M sodyum klorür (NaCl), 0.0027 M potasyum klorür (KCl), 0.01 M fosfat iyonu (PO4^3–), pH 7.4 ± 25 °C'de 0.05).
2. Hayvan hazırlığı
   NOT: Kalsiyum görüntüleme için, bir kalsiyum indikatörü olan GCaMP6s, genellikle dokuya özgü GAL4 ve UAS-GCaMP6s kombinasyonları kullanılarak elde edilen ilgili hücre tipinde ifade edilir. Sinyalin aday reseptör aracılığıyla aracılık etmesini sağlamak için, GCaMP6'lar ayrıca reseptörde kusurlu bir mutantta da eksprese edilir.
   1. Yabani tip ve mutantlar gibi farklı genotipler için deneysel karşılaştırmalar gerektiğinde, GCaMP6 ekspresyon seviyesi varyasyonlarını ve gelişim aşamalarına bağlı fizyolojik farklılıkları önlemek için yaş eşleşmesi test larvaları.
   2. Ebeveyn sineklerini (her cinsiyet için 30 sinek), yiyeceğin yüzeyinde yumurtlamaya izin vermek için 8 saat boyunca standart sinek yemi içeren bir kültür şişesinde tutun. 25 ° C ve% 60-70 bağıl nemde 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsü altında kütle halinde kültür larvaları.

3. Larva beyninin diseksiyonu
   1. {{}}Yumurtlamadan 90-120 saat sonra (AEL), larvaları toplayın ve yapışan yiyecek artıklarını temizlemek için en az 3 kez damıtılmış su ile yıkayın.
   2. Buz gibi PBS ile doldurulmuş kare 1,5 inçlik bir saat camına bir larva yerleştirin.
      NOT: Sonraki iki adım, diseksiyon mikroskobu altında bu saat camında gerçekleştirilir.
   3. Larvaların orta kısmını nazikçe tutmak için forseps kullanın. Ağız kancalarını tutmak için başka bir forseps kullanın ve beyni içeren larvanın ön kısmını vücudun geri kalanından ayırmak için ağız kancalarını nazikçe çekin.
      NOT: Alternatif olarak cerrahi makas da kullanılabilir.
   4. Ön ucu forseps ile tutun ve larvaları ters çevirin. Hayali diskler, yağ cisimleri ve halka bezleri gibi beyne bağlı yabancı dokuları çıkarın. Beyni ağız parçalarından nazikçe ayırın.
   5. Görüntüleme haznesindeki macun benzeri yeniden kullanılabilir yapıştırıcıdan yapılmış halkanın iç kısmına 200 μL PBS uygulayın. Diseke edilmiş beyni PBS ile nazikçe bir Pasteur pipetine emdirin ve ardından görüntüleme odasına aktarın.

4. 1. Ventral gangliyonlardan uzanan kas liflerini tutmak için forseps kullanın. Beyni nazikçe tungsten telin altındaki çukura yerleştirin.
   2. Başka bir forseps kullanarak, beyni görüntüleme için doğru konuma yerleştirmek için tungsten telini hafifçe yukarı çekin (Şekil 1).

2. Ca²⁺ Floresan Görüntülerin Satın Alınması

NOT: {{}}PBS'ye daldırılan beyin eksplantları, 20X suya daldırmalı objektif lens (sayısal diyafram, N.A. = 0.5). PBS beyindeki hücreleri aktive etmez. Z ekseni görüntülerine ihtiyaç duyulursa, objektif lens, piezoelektrikle etkinleştirilen bir lens taşıyıcı ile monte edilir. Zaman çözünürlüğünü artırmak için dönen bir disk konfokal kafa kullanılır. Düşük ışıkta görüntüleme için, mikroskoba elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz kamerası monte edilmiştir. GCaMP6s floresansının (uyarma/emisyon: 488/509 nm) görüntülenmesi, dikroik bir ışın ayırıcı ve bir emisyon filtresi (, örneğin ., 528 ± 38 nm bant geçiren filtre) ile uyarma için 488 nm'lik bir lazer gerektirir.

1. Beyin eksplantını içeren görüntüleme odasını mikroskop altına yerleştirin.
2. Objektif merceği PBS'ye değene kadar indirin. Parlak alan aydınlatması altında beyni konumlandırın ve odaklayın. Floresan ışığa geçin ve GCaMP6s etiketli hücrelere odaklanmayı ayarlayın.
   NOT: GCaMP6'ların bazal yeşil floresansı görünür olmalıdır.
3. Uygun alım yazılımını ( (ör. ., μManager) kullanarak su soğutmalı modda 512 × 512 piksel çözünürlükte 250 ms/kare hızında alıma başlayın. Şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameranın dinamik aralığı içinde, ancak 16 bit görüntülerle (dinamik aralık 0-65,535) 1000'den (rastgele birimler) düşük olmayan floresan değerleri elde etmek için pozlama süresini ayarlayın.
   NOT: GCaMP6'ların foto ağartılmasını en aza indirmek için düşük bir pozlama süresi kullanılmalıdır. Maruz kalma süresi, GCaMP6'nın ifade seviyelerine ve algılama sisteminin hassasiyetine bağlı olduğu için her deneyde optimize edilmelidir. dilp2>GCaMP6s kullanarak yaptığımız deneyde 100 ms idi. Belirli bir görüntüleme derinliği için z kesitleri gerektiğinde, pozlama süresine ve kare aralıklarına bağlı olarak birkaç z kesiti görüntüsü elde edilebilir. Kamera yeterli uzamsal çözünürlüğe sahipse, pozlama süresini azaltmak için gruplama boyutu (çip üzerindeki tek bir dijital piksele bağlanacak kayıt sayısı) artırılmalıdır.
4. Görüntüleme parametreleri belirlendikten sonra, temel sinyal yoğunluklarını (F₀) tespit etmek için peptit uygulamasından önce 1 dakika boyunca görüntü alın.
5. Test peptidini uygulayın; bunun için 100 μL peptit çözeltisini PBS'de çözün ve optimum bir konsantrasyon elde etmek için doğrudan larva banyosuna pipetleyin.
   NOT: Peptit çözeltisi bir pipet kullanılarak banyo çözeltisine yavaşça (} örn. , akış hızı 20 μL/s) enjekte edilmelidir. PBS'de çözünen ilgisiz bir sentetik peptit, negatif kontrol olarak kullanılır.
6. GCaMP6s emisyonunu birkaç dakika boyunca kaydedin.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tungsten çubuk	A-M sistemleri, Sequim, WA, ABD	717000
	Bostik, Paris, Fransa	3049100	Macun benzeri yeniden kullanılabilir yapıştırıcılar
Saat camı, kare, 1 5/8 inç	Carolina Biyolojik Tedarik Şirketi, Burlington, NC, ABD	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japonya	T900	Fosfatlı tamponlu tuzlar
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japonya		Custum ile sentezlenmiş peptit
Ghrerin	Peptid enstitüsü A.Ş., Osaka, Japonya	4372-s
Nociceptin	Peptid Enstitüsü A.Ş., Osaka, Japonya	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Almanya	Axio Imager A2	Floresan mikroskobu
Objektif W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Almanya	420957-9900-000	Suya daldırma objektif lensi
{{}}	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Almanya	N/A	Piezoelektrikle etkinleştirilen lens taşıyıcı
Konfokal tarayıcı ünitesi CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japonya	CSU-W1	Dönen disk konfokal kafa
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japonya	C9100-13	EM-CCD kamera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Tutarlı, Santa Clara, Kaliforniya, ABD	1178770	488-nm lazer
488/568/647 nm Yokogawa dikroik ışın ayırıcı	Semrock, Rochester, NY, ABD	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Dikroik ışın ayırıcı
528/38 nm BrightLine tek bantlı bant geçiren filtre	Semrock, Rochester, NY, ABD	FF01-528/38-25	Emisyon filtresi
μManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org