$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Beyin Ekstraksiyonu, Kesit Alma ve Doku Hazırlama
- Vahşi tip fare suşu C57BL/6'yı CO edin style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2. Servikal çıkık ile ölümü garantileyin.
- Fare kafasını %70 etanol ile temizleyin.
- Steril makas ve forseps kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için önce başın üst kısmından başlayarak cildi çekerek kranektomi yapın.
- Daha sonra kafatası açıkta kaldığında, arka taraftan başlayıp ön tarafa doğru ilerleyerek kemiği parça parça soyarak kafatasını çıkarın. Beyin ventriküllerini tahrip etmemeye dikkat edin.
- Bütün beyni topla.
- Beyni, 10.000 birim / ml penisilin ve 10.000 μg / ml streptomisin içeren ve 37 ° C'ye önceden ısıtılmış% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) / Yüksek Glikoz içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
- Beyni medyan sagital düzlemde keskin bir bıçakla elle dilimleyin ve her iki yarıdan ilk 100-200 mm'lik bölümü elde etmek için bir vibratom kullanın.
- Beyin dokusunu önceden ısıtılmış 37 °C fosfat tamponlu salin (1x PBS) solüsyonu ile durulayın.
- Beyin bölümünü hemen 37 °C'ye ısıtılmış DMEM / Yüksek Glikozlu ortama yerleştirin.
2. Canlı Görüntüleme Yapılandırması ve Kurulumu
- Beyin dokusu kesitlerini 1 ml DMEM/Yüksek Glikoz ortamı içeren 30 mm'lik cam tabanlı kültür kaplarına yerleştirin. Mikroskobun kapalı hazne ortamını 37 °C, %95/%5 O2/CO2 content (Şekil 1).
- 60X objektif yağa daldırma lensi kullanarak, 60X objektif lensine bir yağ damlası yerleştirerek ve düzenli diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ile iletilen ışığa sahip hücrelere odaklanarak ependimal hücreler/kirpikler görüntülerini toplayın.
- Ardından, siliyer atımlar bölgede bir tür baloncuk hareketi oluşturduğundan, hareketli ependimal kirpiklerin konumuna bir rehber olarak DMEM kabarcık hareketinin yönünü takip edin. DIC filtresini kullanarak beynin lateral ventrikülünde hareketli kirpiklere sahip sağlıklı hücreler içeren bir alan seçin. Ependimal kirpikler bulunduğunda, tatmin edici bir görüntü elde etmek için ışığı ve odağı ayarlayın.
- Metamorph görüntüleme yazılımını kullanarak, canlı görüntüleme parametrelerini belirli bir amaca göre ayarlayın. Mevcut gösterimde, 60X objektif ve 5-10 msn pozlama süresi ile birlikte kamera gruplaması 1 x 1'e ayarlanmış yirmi dört bitlik görüntüler elde edin.
- Minimum pozlama süresi için mikroskop açıklığını en uygun seviyeye açarak DIC görüntülerini toplayın. Gecikme olmadan hızlı ve anında görüntü elde etmeyi sağlamak için kameraya aktarılan canlı görüntüleri izleyin. Yeterli görüntü kontrastı elde etmek için minimum pozlama sürelerinin gerekliliğine bağlı olarak kirpiklerin atma hızını hesaplayın.
