$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler uygun kurum tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Hayvan Etik İnceleme Komitesi.
1. Beyin Dokusunun Hazırlanması ve SBFSEM Görüntüleme
- kurumsal yönergeleri izleyerek %4 - 5 izofluran kullanarak genç (~ 2 - 4 aylık) bir C57 siyah fareyi (C57BL/6J suşu) uyuşturun. Kas tonusu kaybını, istemli hareketlerin eksikliğini ve kuyruk tutamağı gibi caydırıcı uyaranlara verilen yanıtları izleyerek anesteziyi onaylayın.
- Fareyi bir diseksiyon tepsisine sabitleyin ve ventral orta hat boyunca cilt üzerinde bir kesi yapın. Farenin göğüs kafesini ortaya çıkarmak için deride daha fazla kesi yapın. Diyaframı kesin, atan kalbi ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu çevre boyunca dikkatlice inceleyin ve ardından sağ atriyumda bir kesi yapın.
- Bir kelebek kanülü kullanarak sol ventrikülü kanül edin. Karaciğer renginde bir değişiklikle kan kaybı doğrulanana kadar, 10 - 20 ml fosfat tampon salin (PBS) pH 7.2 kullanarak fareyi transkardiyal olarak perfüze edin.
Note: Karaciğerin rengindeki bir değişiklik, kan kaybının derecesini belirlemek için bir kılavuz olarak kullanılır. Karaciğer renginin kırmızımsı kahverengiden soluk pembeye değiştiğini onaylayın. - Beyin dokusunu içeriden hızla sabitlemek için 0.10 M kakodilat tamponunda (pH 7.2) yapılan 10 - 20 ml% 2 glutaraldehit ve% 4 paraformaldehit kullanarak fareyi transkardiyal olarak perfüze edin. Fiksasyon, kuyruk sertleşmesi gözlemlenerek izlenir.
Note: 2.14 g sodyum kakodilatı 80 ml suda çözerek 0.10 M kakodilat tamponu (pH 7.2) hazırlayın, pH'ı ayarlamak için hidroklorik asit ekleyin ve hacmi su ile 100 ml'ye getirin. - Perfüzyonu takiben, farenin kafasını dekapitasyon yapın, beyni diseksiyon yapın, ardından 4 yapın span style='font-family: Arial, sans-serif; font-size: 0.6em; font-style: normal; font-variant: normal; font-weight: 400; text-decoration: none; vertical-align: baseline;white-space: pre-wrap;'>oC.
- 48 saat sonra bir vibratom kullanarak 400 μm koronal kesitler yapın ve ardından beyindeki ilgilenilen bölgeyi (örneğin, hipokampus) diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice inceleyin. Dokuyu dikkatlice kesin ve oryantasyonu korumak için bir resim çekin.
Note: SBFSEM'de doku boyama sonrası işlem yöntemleri, çözünürlüğü iyileştirmek için çeşitli ağır metal boyama yöntemlerini birleştirir. . - Gluteraldehit ile sabitlenmiş dokuları 0,1 M kakodilat tamponunda (pH 7,2) her biri 5 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın.
- Tanik asidi 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7.2) çözerek% 0.1 tanik asit çözeltisi hazırlayın. Çözünene kadar döndürün ve gerekirse 0,45 μm'lik bir filtreden süzün.
- RT'de 30-60 dakika boyunca 1 ml reaktif içinde inkübe ederek dokuları koidlat tamponlu% 0.1 tanik asit ile sabitleyin.
Note: Kuluçka süresi doku boyutuna bağlıdır, ancak çoğu doku için 30 dakika en iyi sonucu verir. - Dokuları 3 kez, her biri 5 dakika, kakodilat tamponunda (pH 7.2) yıkayın.
- 0.3 g potasyum ferrosiyanür ve 0.86 g sodyum kakodilatı 10 ml damıtılmış H2O (dH2O). Potasyum ferrosiyanür çözeltisini buz üzerinde tutun. Kullanmadan hemen önce 10 ml %4 osmiyum tetroksit (OsO4).
- Dokuları% 2 osmiyum-ferrosiyanür çözeltisi ile 90 dakika boyunca buz üzerinde boyayın. 3 kez, her biri 5 dakika dH2O.
- 0.1 g TCH'yi 10 ml dH'de çözerek %1 tiyokarbohidrazid (TCH) çözeltisi hazırlayın2O. Tamamen eriyene kadar her 10 dakikada bir döndürerek 60 °C'de çözün. TCH ile çalışırken güvenlik önlemlerine uyun, özellikle metal kullanımından, yüksek sıcaklıklara ısıtmaktan veya çözeltinin kurumasına izin vermekten kaçınmaya dikkat edin.
- Numuneleri RT'de 20 dakika boyunca taze hazırlanmış% 1 TCH ile tedavi edin. Her biri 5 dakika olmak üzere 3 kez dH2O.
- %4 OsO42O ve dokuları 1 saat inkübe ederek %2 sulu osmiyum tetroksit ile boyayın. Yıkama dokular 3 kez, her biri 5 dakika, dH2O.
- Örneklerini dH<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2O at 4 °C.
- Walton'ın kurşun aspartat çözeltisini hazırlayın.
- 0.998 g L-Aspartate'ı 250 ml dH2O ve ardından pH 5,5'e ulaşana kadar damla damla 10 N potasyum hidroksit (KOH) ekleyin. pH ayarlamasından sonra 10 ml aspartik asit stoğuna 0.066 g kurşun nitrat ekleyin ve 30 dakika boyunca 60 °C'ye ısıtın.
- Dokuları dH='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'2O ve Walton'ın kurşun aspartat boyası ile 60 ° C'lik bir fırında 30 dakika inkübe edin. dH2O.
- Her biri 5 dakika boyunca %20, %50, %75, %85 ve %95 etanol içeren soğutulmuş çözeltiler kullanarak numuneleri kademeli bir alkol serisinden dehidre edin, ardından her biri 10 dakika olmak üzere 3 kez %100 etanol ekleyin.
Note: Taze açılmış şişelerden% 100 etanol kullanın, çünkü açılmış etanol havadaki suyu emer ve gömmenin başarısız olmasına neden olur. Daha büyük doku örneklerinde daha uzun inkübasyonlar gerekli olacaktır. - Numuneleri propilen oksit içinde her biri 15 dakika olmak üzere 2 kez yıkayın.
- 25 ml reçine, 10.5 ml DDSA (dodecenyl süksinik anhidrit), 15.5 ml NMA (nadik metil anhidrit) ve 1 ml DMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol) kullanarak plastik gömme reçinesi yapın. Reçineyi çalkalayarak karıştırın. Döndürün ve kabarcıklar çözülene kadar reçinenin durmasına izin verin.
Note: Bu standart orta sertlik tarifidir. Diğer elektron mikroskobu (EM) plastik reçine türleri kullanılabilir, ancak tüm reçineler SBFSEM için çalışmadığından, önceden gerekli olmayan bir kontrol numunesi ile test edilmelidir. - O / N dokularını, başlangıçta kapaklı ve 2 saat sonra kapaksız bir şişede 50: 50 gömme reçine ve propilen oksit karışımında inkübe edin, böylece propilen oksit yaklaşık 8 - 10 saatlik bir süre boyunca buharlaşır.
- Dokuları 2 saat boyunca temiz şişelerde% 100 taze gömme reçinesine aktarın.
- Numuneleri taze gömme reçinesine, basılı kağıt etiketler içeren düz kalıplara gömün ve 60 ° C'de 48 saat fırında kürleyin. Yaklaşık 1 saat sonra doku yerleşimini ve hizalamasını tekrar kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
- Numuneleri ilgilenilen alana göre kesin ve jelleşen siyanoakrilat süper yapıştırıcı veya iletken bir epoksi reçine kullanarak bir alüminyum pim üzerine monte edin. Ardından, alüminyum pime iletken bir yol sağlamak için bloğun kenarlarını kolloidal gümüş macunu ile kaplayın.
- Oda içi ultramikrotom aşaması ve düşük kV geri saçılmalı elektron detektörü ile donatılmış bir taramalı elektron mikroskobu sistemi kullanarak doku örneklerini inceleyin.
Not: Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanımı konusunda cihaz ve saha eğitimi alın ve yetkili bir kullanıcı olun. Alternatif olarak, küçük projeler için bir araştırmacı veya çekirdek tesis ile işbirliği yapmak mümkün olabilir. SEM'ler x-ışınları ürettiği için radyasyon eğitimi de gerekli olabilir. - Örnekleri görüntülemek için aşağıdaki ayarları kullanın: 2,25 kV, 5 - 10 nm/piksel çözünürlükte, alan boyutları x,y cinsinden 80 - 250 μm arasında (diğer alan boyutları mümkündür) ve 50 - 100 nm dilim kalınlığı, 16 - 20 saatlik bir zaman diliminde toplam 250 - 600 dilim.
Note: Ayarlar, farklı mikroskoplar, bireysel numuneler ve istenen çözünürlük arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu ayarlar, birçok örnek için kolayca yorumlanabilen görüntüler üretmelidir.
2. Görüntüleme Veri Kümesini Analiz Etme
Not: Image J/Fiji yazılımı, veri kümesini analiz etmek için kullanılır ve TrakEM2 eklentisine dayanır. Ön işleme adımları, çeşitli yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir ve deneyim düzeyine ve elde edilen yığınlara bağlı olarak kapsamlı veya küçük olabilir. Açık kaynaklı yazılımı (ImageJ ver 1.50b, FIJI indirme 1 Ekim 2015) kullanan ana dönüşümler burada açıklanmıştır.
- Yazılımı açıp Image→Type→8 bit menü öğelerini seçerek görüntüleri orijinal tescilli 16 bit görüntülerden 8 bit tiff formatına dönüştürün.
- Bu adım sırasında otomatik kontrast/parlaklık dönüşümü görüntüler için ideal değilse, 16 bit görüntüleri yeniden açın ve Image→Adjust→Brightness/Contrast tuşuna basın. Tüm görüntüler için çalışan bir aralık seçin ve Uygula'ya basın. Ardından dönüştürme işlemini gerçekleştirin. Note: Bazı SEM'lerde bu adım mikroskop gerektirebilir üretici yazılımı.
- Gerekirse, dilimler arasındaki kabul edilemez görüntü hareketi nedeniyle (e.<span style='font-family:Arial,sans-serif; yazı tipi boyutu: 12pt; font-style:normal; font-variant:normal; yazı tipi ağırlığı: 400; metin-dekorasyon:yok; dikey hizalama: taban çizgisi; white-space:pre-wrap;' >. şarj nedeniyle kayma), görüntü yığınlarını kaydedin/hizalayın (menü öğeleri Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). Çoğu kayıt yazılımında, "sert gövde" yerine "yalnızca çeviri" modu için ayarlayın.
Note: Birçok yaklaşım ve yazılım işe yarayabilir: SIFT kayıt eklentisi birçok uygulama için çalışır ve sanal bir yığın sürümü vardır.- Gerekirse, kayıttan önce tuval boyutunu büyütün (Image→Adjust→CanvasSize) veya ilgi alanına küçültün (Image→Crop).
Note: Bazı kayma veya yayılma meydana gelebilir ve diğer eklentileri veya yazılımları denemek daha iyi sonuçlar verebilir. Manuel seçenekler de mevcuttur (e.<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. ImageJ/FIJI, Plugins→Registration→ManualLandmarkSelection).
- İstenirse, görüntüleri daha küçük, daha yönetilebilir bir boyuta ölçeklendirin (e.<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. %25) (Image→Scale) kullanarak ölçeklendirin) olarak adlandırılır.