Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Özet

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir. Yöntem, dendritik morfolojiyi ve tabakalaşmayı analiz ederek, farklı RGC alt tiplerinin sınıflandırılmasını sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik incelemesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Retina Dokusunun Hazırlanması (2 saat)

NOT: Bu bölümdeki tüm işlemler loş kırmızı aydınlatma altında yapılmalıdır

1. {{}}Koyu renkli hayvanlar diseksiyondan en az 1 saat önce. Tüm prosedürleri loş kırmızı aydınlatma altında gerçekleştirin.
2. Hayvanları CO₂ boğma ile ötenazi yapın ve gözbebeklerini önceden oksijenlenmiş hücre dışı çözelti ile bir Petri kabına enüklee edin.
3. Korneayı bir iğne ile dürtün ve kornea ve sklera sınırında oftalmik makasla keserek kesin.
4. #5 forseps kullanarak lensi çıkarın. Forseps ile sklerada nazikçe bir yırtık yapın ve retina ile skleranın birleştiği optik siniri kesin. Sklerayı retinadan çıkarmayı dikkatlice bitirin.
5. # 5 forseps kullanarak şeffaf vitreusu çıkarın; Çıkarıldıktan sonra vitreus, forsepslere yapışmış jelatinimsi bir madde olarak görünür. Retinaları ikiye bölün (4 parça/hayvan olacak şekilde) ve kullanana kadar RT'de oksijenli hücre dışı solüsyonda saklayın.
6. Dokuyu kayıt odasına monte etmeye hazır olduğunuzda, 500 μL oksijenli hücre dışı çözelti içinde seyreltilmiş enzim çözeltisinde inkübe etmek için bir retina parçası yerleştirin. Bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca bir Petri kabında inkübe edin.
   1. Retina parçasını oksijenli hücre dışı solüsyonda yıkayın ve dokuyu cam tabanlı bir kayıt odasına yerleştirin; Retinanın dokuya zarar vermeden aktarılmasını sağlamak için ucu kesilmiş plastik bir transfer pipeti kullanın.
7. Fotoreseptör tabakası aşağı bakacak şekilde dokuyu dikkatlice düzleştirmek için forseps kullanın. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın. Naylon örgülü bir platin halka kullanarak dokuyu sabitleyin.
   NOT: Bu yöntem, etiketli amakrin ve bipolar hücrelerden RNA'nın izolasyonu için dokuyu hazırlamak için de kullanılabilir.
8. Odayı oksijenli hücre dışı çözelti ile doldurun ve bir mikroskop sahnesine monte edin. 2-4 mL/dk'da oksijenli hücre dışı çözelti ile doku perfüz.

3. GFP+ Retina Ganglion Hücrelerinin Görselleştirilmesi ve Hedeflenmesi (10 dk)

NOT: Bu bölümdeki tüm işlemler loş kırmızı aydınlatma altında yapılmalıdır

1. {{}} Başlamadan önce, Mikropipet çektirme kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar için cam mikropipetleri (dış çap [OD]: 1,2 mm, iç çap [ID]: 0,69 mm) çekin. Elektrotlar için aşağıdaki protokolü kullanın (istenen direnci elde etmek için parametrelerin buna göre ayarlanması gerektiğini ve çektirmeler arasında ve farklı camlara göre değişeceğini lütfen unutmayın): Isı: Rampa +10; Çekme: 0; Vel: 23; Gecikme: 1; Basınç: 500; Program döngüsü: 5 kez. Uçların çapının ~ 1 μm olduğundan, büyük hücreleri hedeflemek için 2-4 MΩ ve daha küçük hücreleri hedeflemek için 5-7 MΩ dirençle olduğundan emin olun.
2. Kızılötesi Diferansiyel Girişim Kontrastı (IR-DIC) optiği (Şekil 1A) kullanarak ganglion hücre katmanını gözlemleyin. Epifloresan (~480 nm) kullanarak Yeşil Floresan Proteini (GFP)+ Retinal Ganglion Hücrelerini (RGC'ler) tanımlayın (Şekil 1B).
3. DIC'de hücre içi çözelti ile doldurulmuş pipeti bulun. Amplifikatöre hafif bir pozitif basınç ve sıfır voltaj ofseti uygulayın.
4. Cam mikropipeti bir GFP+ hücresine bastırın ve pipet ile hücre zarı arasında bir GΩ contası oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Sızdırmazlık direncini izlemek için test voltajı komut adımlarını (, örneğin, 5 mV) uygulayın. Stabil bir sızdırmazlık oluşturduktan sonra, tüm hücre erişimi elde etmek için kısa negatif basınç darbeleri uygulayarak zarı yırtın.
5. Hücrenin dendritlerinin floresan izleyici ile dolması için 1-2 dakika bekleyin.
   NOT: Hücre, epifloresansta morfoloji incelenerek morfolojik olarak tiplendirilebilir (Şekil 1C). Melanopsin eksprese eden RGC'ler söz konusu olduğunda, iç pleksiform tabakadaki dendritik tabakalaşma, epifloresan aydınlatma altında floresan izleyici ile doldurulmuş dendritlerin incelenmesi ve bunların KAPALI sublaminadaki (M1 ipRGC'ler) soma'dan uzakta, ON sublaminasındaki ganglion hücre tabakasının yakınında (M2 ve M4 ipRGC'ler) veya her ikisinde (M3 ipRGC'ler) tabakalaşıp tabakalaşmadığının belirlenmesiyle görselleştirilir. Bu gözlem, soma boyutu ile birleştirildiğinde (M4'ler, diğer tüm ipRGC alt tiplerine kıyasla belirgin şekilde büyük somalara sahiptir), hücre tipinin tanımlanmasına izin verir. Bu nedenle, bu teknik, RNA izolasyonundan önce in vitro hücre tipinin tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem, dendritik morfoloji veya hücresel fizyolojiyi içeren diğer hücre tipi tanımlama protokolleri için değiştirilebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Melanopsin eksprese ...

Malzemeler