Miyelinli Fare Aksonlarında Nörofilament Taşınmasının Floresan Fotoaktivasyon Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Boyer, N. P. et. al., Eksize Fare Tibial Sinirinde Nörofilament Taşınmasının Görüntülenmesi ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemini göstermektedir. periferik sinirlerin miyelinli aksonlarında nörofilament taşınımı. Teknik, fotoaktif yeşil florofor etiketli nörofilamentleri izleyerek, nörodejeneratif hastalıklarda aksonal taşıma hakkında bilgi sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirildi.

1. Sinir salin solüsyonunun hazırlanması

1. 100 mL Breuer tuzlu su yapın: 98 mM sodyum klorür (NaCl), 1 mM potasyum klorür (KCl), 2 mM potasyum di-hidrojen fosfat (KH₂PO₄), 1 mM magnezyum sülfat (MgSO₄), 1,5 mM kalsiyum klorür (CaCl₂), %5,6 D-glukoz, 23,8 mM sodyum bi-karbonat (NaHCO₃) çift damıtılmış suda.
2. Kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca tuzlu su çözeltisinden% 95 oksijen /% 5 karbondioksit (karbojen) kabarcıklayın. Artık tuzlu su bir hafta içinde tekrar kullanılabilir; Bununla birlikte, her kullanımdan önce yeniden oksijenlendirilmelidir.
3. Oksijenli salini 60 mL'lik bir şırıngaya dökün ve şırıngada minimum hava kaldığından emin olun.

2. Sinir perfüzyon odasının ilk montajı

1. Şırıngayı ve hortumu gösterildiği gibi bağlayın <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Figure 1A, çıkış tüpünü bir atık şişeye yerleştirme.
2. Dış contayı, akış giriş ve çıkış direklerinin contadaki deliklerle hizalandığından emin olarak perfüzyon odası muhafazasına yerleştirin.
3. İç contayı (silikon, 100 μm kalınlığında) #1.5 dairesel lamel (40 mm çapında) üzerine yerleştirin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için contadaki kırışıklıkları dikkatlice düzeltin. Daha sonraki montajı kolaylaştırmak için, lamel ve contayı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin veya conta yukarı bakacak şekilde görev mendili yapın.

3. Fare tibial sinirinin diseksiyonu ve hazırlanması

1. Hayvanı karbondioksit soluma veya kurumsal olarak onaylanmış başka bir yöntemle kurban edin. Hayvan hareketi/nefes almayı bıraktığında bir zamanlayıcı başlatın, çünkü deneyler yalnızca kurban edildikten sonraki 3 saat içinde yapılmalıdır.
2. Kürkü% 70 etanol ile püskürtün ve elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak hayvanın bacaklarından ve sırtından mümkün olduğunca çıkarın.
3. Bir çift büyük diseksiyon makası kullanarak, omurganın ortasına yakın deride bir dorsal kesi yapın ve hayvanın ventral yönü etrafındaki kesime devam edin. Bu kesiden başlayarak, cildi kastan nazikçe çekerek ve fasyayı keserek bacaklardan yavaşça yansıtın.
4. Hayvanı bir diseksiyon tepsisine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve dört pençeyi de sabitleyin. İsteğe bağlı olarak, hareketi daha da azaltmak için kuyruğu sabitleyin.
5. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, siyatik siniri ortaya çıkarmak için kuyruk ve diz arasındaki uyluk kaslarında bir kesi yapın. Kas içinden görünen sinirin kesilmediğinden emin olun.
6. Kası çıkarmak için kesiyi dorsal ve ventral olarak uzatın. Benzer şekilde, sinirlere zarar vermemek için kesikleri sığ ve kısa tutarak baldır kaslarını çıkarın.
7. Tibial sinir, siyatik sinirden (dizde) topuğa dallandığı noktadan tamamen açığa çıkana kadar kasları çıkarın (Figure 2A).
   NOTE: Tibial sinirin diseksiyonu da dahil olmak üzere tüm adımlarda, sinirdeki fotoaktive edilebilir yeşil floresan proteinin (paGFP) olası tesadüfi aktivasyonunu en aza indirmek için gereksiz ortam ışığına maruz kalmaktan kaçının.
8. Omurganın proksimal ucundaki tibial siniri bir çift forseps ile kavrayın ve bir çift mikrodiseksiyon makası kullanarak siniri kesin. Siniri gerginleştirmemeye dikkat edin, kasın dışına kaldırın, herhangi bir eki kesin.
9. Tibial sinirin omurga distal ucunu kesin ve oda sıcaklığında oksijenli salin içeren küçük bir Petri kabına aktarın. Prosedürün bu noktasından itibaren, her zaman sinirin proksimal ve distal uçlarını takip ettiğinizden emin olun.
   NOTE: Bunu yapmanın bir yolu, sinirin distal ucunu, koniklik görünecek şekilde açılı bir kesi ile işaretlemektir.
10. Sinirin proksimal ucundan başlayarak, açıkta kalan akson uçlarını bir çift çok ince uçlu forseps ile nazikçe kavrayın.
11. İkinci bir forseps çifti ile sinir kılıfını proksimal olarak kavrayın ve yavaşça sinirin distal ucuna doğru çekin. Sinir kılıfı, minimum dirençle aksonlar boyunca kayacaktır. Bu işlem sırasında sinire aşırı gerginlik uygulanmadığından emin olun.

4. Son sinir perfüzyon odası assembly

1. Sinirin proksimal ucunu kavrayarak, onu salinden çıkarın ve yavaşça iç contanın dikdörtgen açıklığı içindeki perfüzyon odasının lamel üzerine yatırın, düz duracak şekilde yatırırken sinir üzerinde hafif bir gerginlik sağlayın.
2. Mikro su kemeri sürgüsünü, yivli tarafı sinire bakacak ve akış yönü sinire paralel olacak şekilde sinirin üzerine yerleştirin. Lameli ve mikro su kemeri tertibatını ters çevirin ve mikro su kemeri sürgüsü dış contaya takılı olarak perfüzyon odası muhafazasına yerleştirin. Sinir ve çevresindeki iç conta şimdi, lamel yukarı bakacak şekilde, conta tarafından ayrılan lamel ile mikrosu kemeri sürgüsü arasına sıkıştırılacaktır (Figure 1B).
3. Perfüzyon odasını metal muhafazaya yerleştirerek ve kilitleme halkasını döndürerek sabitleyin. Plastik muhafazanın tüm metal klipslerin altında olduğundan emin olun ve tuzlu su sızıntısını önlemek için iyice sıkın. Aşırı sıkma, mikro su kemeri sürgüsünü veya lamel çatlatabilir. Lamel aşağı bakacak şekilde hazneyi ters çevirin.
4. Perfüzyon odasını doldurmak için salin şırınga pistonuna yavaşça bastırın. Kurulum ve görüntüleme sırasında giriş ve çıkış borusunu, çıkış şişesini ve şırıngayı her zaman haznenin üzerinde yukarıda tutun. Bu, haznedeki negatif basınç nedeniyle kabarcıklara neden olabilecek veya odak kararsızlığına neden olabilecek sifonlamayı önler.
5. Perfüzyon düzeneğini ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına aktarın ve salin şırıngasını şırınga pompasına monte edin. Motoru 0,25 mL/dk'lık bir akış hızı için uygun bir hızda çalıştırın. Ardından, 37 °C'ye ayarlanmış hat içi çözelti ısıtıcısını bağlayın ve açın.
6. Objektif ısıtıcısını bağlayın ve 37 °C'ye ayarlayın, objektife yağ uygulayın ve perfüzyon odasını sahne montajına yerleştirin.
7. Hazne ısıtıcı pedine yağ sürün ve perfüzyon haznesine takın. Oda ısıtıcısını bağlayın ve açın; 37 °C'ye ayarlayın.
   NOTE: Sıcaklıktaki değişiklikler, çözeltinin gazının dışarı çıkması nedeniyle perfüzyon odasında kabarcıkların oluşmasına neden olabilir. Kabarcıklar oluşursa, kabarcıklar hazneyi temizleyene kadar çözelti akış hızını kısaca 5-10 kat artırın.
8. Perfüzyon haznesini s'ye kilitleyintage adaptör ve objektif yağı haznenin alt tarafındaki lamel ile temas ettirin.
   NOTE: Burada kullanılan ASI kademe adaptörlü Bioptechs odası, ters çevrilmiş bir mikroskop konfigürasyonu için tasarlanmıştır.

5. Floresan aktivasyonu ve görüntü elde etme

1. Brightfield aydınlatmasını kullanarak, lamel yüzeyine en yakın sinirin alt yüzeyindeki akson tabakasına odaklanın (Figure 2B). Miyelinli aksonlar (yetişkin farelerde tipik olarak 1-6 μm çapında), kontrast artışı olmaksızın parlak alan ile iletilen ışık aydınlatması altında görülebilen bir miyelin kılıfının varlığı ile tanımlanabilir. Schmidt-Lanterman yarıkları ve Ranvier düğümleri de kolayca görülebilir. Miyelinsiz aksonlar daha incedir (tipik olarak <1 μm çapındadır) ve genellikle birbirlerinden çözülemeyecek kadar yakın oldukları demetler (Remak demetleri) halinde bulunurlar.
2. Mikroskopta varsa, hızlandırılmış görüntüleme boyunca odağı korumak için otomatik odaklama sistemini etkinleştirin.
3. Bir parlak alan referans görüntüsü elde edin. Sinirin oryantasyonunu (omurga-proksimal ve distal uçlar) görüntülere göre kaydedin.
4. Ağartma öncesi otofloresansı kaydetmek için 488 nm lazer ve paGFP'ye uygun bir emisyon filtresi (örn. 525/50 nm) kullanarak konfokal bir görüntü elde edin. Foto ağartmayı en aza indirmek için lazer gücünü düşük tutun ve pozlama süresi zayıf sinyali algılamak için buna göre ayarlayın. Örnek olarak, temsili veriler %5 lazer gücünde ve 4 sn maruziyette elde edildi. Gelecekteki tüm deneylerde kullanmak üzere edinme ayarlarını kaydedin.
   NOTE: Fotoaktivasyondan sonra, ideal görüntüleme ayarları, 8'> bir sinyal-gürültü oranı ve 20 görüntü boyunca orijinal sinyalin %25'inden daha az foto ağartma üretecektir. Aksonlar, başlangıçta yaptığımız gibi geniş alan epifloresan mikroskobu ile de görüntülenebilir, ancak konfokalite eksikliği nedeniyle görüntü kalitesi daha düşük olacaktır.
5. Lazer gücünü normal görüntüleme gücünün yaklaşık 5 katına ayarlayın ve 3-4 dakikalık pozlama süresine sahip bir görüntü elde edin. Gerekli olmasa da, bu adım, arka plan sinyalini azaltmak ve böylece fotoaktif floresanın sinyal-gürültüsünü en üst düzeye çıkarmak için otofloresan ve diğer istenmeyen floresan kaynaklarını ağartmak için önerilir.
6. Bu ağartma adımından sonra aktivasyon öncesi otofloresanı kaydetmek için adım 5.4'te kullanılan ayarlarla bir görüntü elde edin.
7. Parlak alan görüntüsünde, istenen aktivasyon penceresi boyutuna eşit uzunlukta aksonlara paralel bir çizgi çizin. Bu pencerenin uzunluğu, deneysel hedefe ve parametrelere bağlı olarak değişecektir, ancak tipik uzunluklar, darbe kaçış paradigması için 5 μm ve darbe yayılma paradigması için 40 μm'dir.
8. Bu çizgiyi bir kılavuz olarak kullanarak, aksonlara dik görüş alanı boyunca dikdörtgen bir ilgi alanı (ROI) çizin. Bölgenin fotoaktif hale getirilmesi için tüm aksonları kapsaması gerekir.
9. 405 nm aydınlatma ile fotoaktivasyon için en uygun ayarları belirleyin.
   NOTE: Bu adımı ve alt adımları yalnızca ilk deneysel etkinleştirmeden önce gerçekleştirin. Bir deney boyunca, aynı fotoaktivasyon ayarları kullanılmalıdır.
   1. 405 nm lazer çizgisi, düşük lazer gücü (örn. %5) ve piksel bekleme süresi (örn. 40 μs) ve bir darbe kullanarak ilgilenilen bir bölgeyi tekrar tekrar etkinleştirin ve her aktivasyondan sonra aktive edilmiş yeşil floresan proteininin veya GFP floresansının bir görüntüsünü elde edin. Floresan artık artmayana kadar tekrarlayın ve ardından her görüntü için ilgilenilen bir bölgedeki floresanı ölçün.
   2. Nabız sayısına karşı ortalama floresan yoğunluklarını çizin. Aktivasyon için en uygun darbe sayısı olarak floresansın artık artmayacağı darbe sayısını seçin.
10. Adım 5.8'de çizilen bölgedeki paGFP floresansını 405 nm ışıkla desenli uyarma ile etkinleştirin. Etkinleştirmeden hemen önce ve hemen sonra bir görüntünün alındığından emin olun.
    NOTE: İdeal paGFP aktivasyonu, ilgilenilen bölge veya ROI içinde yer alan keskin sınırlara sahip, açıkça tanımlanmış bir floresan bölgesi üretecektir.
11. Etkinleştirme bittiğinde 1 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. 1 dakikanın sonunda, bir timelapse serisi edinmeye başlayın.
    NOTE: paGFP'nin fotoaktivasyonunu takiben gözlenen floresan artışına izin vermek için 1 dakikalık gecikme gereklidir. Darbe yayma yöntemi için, hız ve yönlülüğü ölçmek için merkezi ve yan pencerelerdeki ilk eğimlerin ölçümü için 30 saniyelik timelapse aralıklarıyla 5-10 dakikalık bir alım periyodu yeterlidir. Darbeden kaçış yöntemi için, 5 veya 10 dakikalık timelapse aralıklarla 30-150 dakikalık bir edinme periyodu, filamentlerin uzun vadeli duraklama davranışının analizine izin verir.
12. Elde edilen tüm görüntüleri ve floresan aktivasyonu için kullanılan yatırım getirisini kaydedin.
13. Sinirin yeni bir bölgesine geçin ve 5.1-5.11 adımlarını tekrarlayın. Yeni bölge aynı akson boyuncaysa, diğer aktive edilmiş bölgeden dışarı çıkan floresan nörofilamentlerin tespit edilmesini önlemek için daha önce aktive edilmiş bölgeden en az 500 μm uzakta olmalıdır. Son timelapse'ın alınması, 3 saatlik pencerenin bitiminden önce tamamlanmalıdır.
    NOTE: Preparatın 3 saatten daha uzun süre uygulanabilir olması mümkündür, ancak bunu doğrulamadık. Usta bir diseksiyon ve hazırlıkla, bu 3 saatlik zaman diliminde beş ila sekiz adet 10 dakikalık timelapse görüntü seti elde edilebilir.
14. Son timelapse görüntü serisi elde edildikten sonra, salin akışını durdurun, çözeltiyi ve hazne ısıtıcılarını ayırın ve perfüzyon aparatını mikroskop aşamasından çıkarın.

Sonuçlar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
14 x 22 Dikdörtgen conta 0,1 mm	Bioptechs	1907-1422-100	Inner gasket
2-deoksi-D-glikoz	Sigma	D6134
30mm Delikli Yuvarlak conta	Bioptechs	1907-08-750<
35 x 10mm çanak	Thermo Fisher	153066	Dissection dishes
40mm yuvarlak lameller	Bioptechs	40-1313-0319
60mL şırınga - Luer-lock ucu	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk konfokal sistem	Andor		Perfect Focus ve FRAPPA sistemleriyle donatılmış
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	Floresein slaydı için
D-(+)-glukoz solution	Sigma	G8769
Diseksiyon pimleri	Fine Science Tools	26001-70
Diseksiyon forseps	Fine Science Tools	11251-30<
Diseksiyon mikroskobu	Zeiss	47 50 03
Balmumu ile diseksiyon tavası	Ginsberg Scientific	568859
Diseksiyon makası	Fine Science Tools	14061-09	İlk diseksiyon makası
FCS2 perfüzyon odası	Bioptechs	60319-02-03
Fluorescein sodyum	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Laminektomi forseps	Fine Science Tools	11223-20	İlk diseksiyon forseps
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Mikroskop slaytları	Fisher	12-544-3	For fluorescein slide
Mikroskop aşaması ekleme	Applied Scientific Instrumentation	I-3017<
Objektif ısıtıcı sistemi	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	continued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objektif	Nikon	MRD01901
Potasyum klorür	Fisher	P217
Potasyum fosfat	Sigma-Aldrich	P0662
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S6297
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	S7653
Şırınga pompası	Sage Instruments	Model 355
Boru adaptörü - dişi	Small Parts Inc.	1005109
Boru adaptörü - erkek	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" duvar kalınlığı
Vannas yaylı makas	Fine Science Tools	15018-10	ince makas

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Outer gaskettd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>İnce uçlu forsepstd style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>