Bu video, anestezi uygulanmış bir transgenik fare yavrusunun beynindeki nöronları görüntülemek için kullanılan iki foton mikroskobunu göstermektedir. İki fotonlu lazer, yüksek uzamsal çözünürlük ve minimum ışık saçılımı ile daha derin görüntülemeye olanak tanıyarak dendritik projeksiyonlar da dahil olmak üzere nöronal morfolojinin ayrıntılı bir şekilde yakalanmasını sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Fare Yavrusunda Nöronal Morfolojiyi Görüntülemek için İki Foton Mikroskobu
1K görüntülenme
⸱
29 Mayıs 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veterineri tarafından gözden geçirilmiştir inceleme panosu.
1. Cranial Window Preparation
- İzofluran (%1.0 - %2.0) kullanarak yavruyu uyuşturun ve kuyruk tutamlama testi ile anestezi seviyesini kontrol edin.
- Kafatasını sterilize edilmiş bir tıraş bıçağıyla dikkatlice açın ve durayı sağlam bırakın (1 mm çapında) (Figure 1C). Korteks tamponuna batırılmış bir jelatin sünger kullanın (sterilize edilmiş makas kullanarak yaklaşık 2 mm3 < küçük parçalar halinde kesin ve cımbız kullanarak uygulayın) (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glikoz, 10 mmol/L HEPES (4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit), 2 mmol/L CaCl2 ve 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; oda sıcaklığı) kanamayı durdurmak için. Kafatasını açarken, beyin yüzeyini nemli tutmak için bir korteks tamponu uygulayın.
- Jelatin sünger kullanarak, dural yüzeydeki herhangi bir tamponu ve kanı temizleyin. Sarı uçları kullanarak, %1.0 düşük erime noktalı agarozdan (korteks tamponunda çözülmüş) oluşan ince bir tabaka uygulayın. Bir ısı bloğu makinesi kullanarak, uygulamaya kadar agaroz çözeltisinin sıcaklığını 42 ° C'de tutun.
NOT: Tampon ve kanın boşaltılması, kuru jelatin süngerin dura ile temas etmemesine dikkat edilerek kraniotominin yanından yapılmalıdır. Bunun yapılmaması duraya zarar verebilir. - Agaroz jel tabakasının üzerine yuvarlak bir cam lamel (No. 1, 3 mm çapında) uygulayın. Lamel ile agaroz jel tabakası arasındaki tüm kabarcıkları, aralarına fazla agaroz jeli dökerek çıkarın. Cımbız kullanarak lamel altından çıkıntı yapan fazla jeli çıkarın (Figure 1D ve1E).
- Lameli diş çimentosu (Figure 1F).
- Çimento tozunu ve çimento sıvısını karıştırın. Karışımı katılaşmadan önce sarı uçlar kullanarak uygulayın. Dura üzerine diş çimentosu uygulamayın, çünkü bu beyne zarar verebilir.
- Steril bir titanyum çubuk takın (özel yapım, yaklaşık 30 mg, bkz. Figure 1G) diş çimentosu kullanarak kafatası kemiği üzerinde. Kolayca görüntü yakalamak için titanyum çubuğu ve lamel (duranın yüzeyinde) paralel olarak hizalayın.
- Açıkta kalan kafatasını diş çimentosu ile örtün (Figure 1H).
- Yavruyu anesteziden kurtarın. Diş çimentosu katılaşana kadar (1 saat) bir ısıtıcıda (37 °C) tutun.
2. Two-photon Imaging
- İki fotonlu lazer dalga boyunu ayarlayın. RFP (Kırmızı floresan protein) uyarımı için 1.000 nm (400 μm derinlikte 450 mW/mm2) kullanın.
NOTE: Lazer gücü Z konumu yukarı hareket ettikçe azaltılmalıdır. - Lamelin yüzeyini %70 etanol ile silin.
- İzofluran (% 1.5 -% 2.0) kullanarak yavruyu uyuşturun ve bir kuyruk tutamlama testi kullanarak anestezi seviyesini kontrol edin.
- Yavrunun kafasındaki titanyum çubuğu kullanarak yavruyu görüntüleme sahnesindeki titanyum plakaya takın (Figure 2A and 2B). Açıölçer aşamasını kullanarak lamel objektif merceğe paralel olacak şekilde başlığı ayarlayın (Figure 2B). Bir ısıtma yastığı (37 °C) kullanarak yavrunun vücut ısısını koruyun.
- İzofluran konsantrasyonunu% 0.7 -% 1.0 olarak ayarlayın.
NOTE: Çok yüksek bir izofluran konsantrasyonu, görüntüleme sırasında yavrunun kazara ölümüne neden olabilir. - Görüntüleme aşamasını iki fotonlu mikroskobun objektif merceğinin (20X, NA 1.0) altına yerleştirin (Figure 2B and 2C).
- Lamelin üzerine bir damla su sürün. Duranın maruz kaldığı bölgedeki floresan proteini etiketli nöronları bulmak için epi-floresan kullanın.
- 1,4 μm aralıklarla z-yığını görüntüleri elde edin. Katman 4 nöron görüntüleme için, tüm dendritik morfolojiyi (Figure 2D ve 2E). Nöronal morfolojiyi gösteren net görüntüler elde etmek için yavaş tarama ve ortalama alma kullanın (tüm dendritik morfolojiyi elde etmek genellikle > 20 dakika sürer).
NOT: Görüntüleme için aşağıdaki parametreler önerilir. Uyarma dalga boyu: 1.000 nm, tarayıcı: galvanometre tipi, dikroik ayna: 690 nm, emisyon filtresi: 575 - 620 nm bant geçişi, dedektör: GaAsP tipi, kazanç ayarı > 100, görüntü boyutu > 512 x 512 μm, görüş alanı > 600 x 600 μm, piksel çözünürlüğü < 1,2 μm.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1: Ameliyat, kafatası penceresi hazırlığı ve titanyum çubuğun takılması. (A) Bu panel, kafatasını kap...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pK031. TRE-Cre | |||
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | |||
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | |||
| Isoflurane | |||
| 410 Anestezi Ünitesi (isofluran gaz makinesi) | Univentor | ||
| Vetbond (doku yapıştırıcısı) | |||
| MμltiFlex Round (yükleme ucu) | |||
| Jel köpük (jelatin sünger) | |||
| Agarose | |||
| Round-shaped coverslip | Matsunami | ||
| Unifast 2 (dental cement) | GC | ||
| Titanium bar | |||
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis< | ||
| 2-photon microscope | Zeiss | ||
| Titanyum-safir lazer | |||
| Titanium plate | |||
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| gonyometre aşaması |
