Drosophila Beyin Yapılarında Kalsiyum Geçişlerini İncelemek için Biyolüminesans Görüntüleme

Özet

Kaynak: Lark, A. R., et. al., Biyolüminesan Kalsiyum İndikatörü GFP-aequorin'e Dayalı İn Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşımı. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, Green kullanarak kalsiyum dinamiğinin gerçek zamanlı görüntülemesini göstermektedir. Drosophila'nın derin beyin yapılarında floresan protein-aequorin biyolüminesansı.

Protokol

1. Görüntüleme

1. Kurulum
   1. Mikroskobu, bilgisayarı, kamerayı ve drenaj sistemini açarak ve oda çevre kontrollerini 25 °C'ye ayarlayarak kayıt sistemini başlatın.
   2. Ölçümü açın ve Bilgisayardaki Otomasyon Gezgini programı. "Aygıtlar ve Arayüzler"e tıklayın, ardından "NI Hareket Aygıtları"na çift tıklayın ve son olarak "PCI-7334"e sağ tıklayın ve "cihazı başlat"ı seçin.
   3. Photon Imager'ı açın. Yeni bir klasör oluşturun ve ilk kayıt dosyasını adlandırın. Sistemin çalışabilmesi için kameranın -80 °C'ye ulaşması gerekir.
   4. Perfüzyon sistemini kurun: Rezervuarlara KCl (potasyum klorür), nikotin ve Ringer solüsyonunu ekleyin ve her solüsyon 2 ml / dk'da boşalacak şekilde ayarlayın. Deneye başlamadan önce Ringer solüsyonu ile yıkayın.
2. Numune hazırlayın
   1. Görüntüleme montaj blok çanağını mikroskop altında 5X büyütmede montaj üzerine yerleştirin ve perfüzyon tüpünü delikten kanala yerleştirin.
   2. Mikroskobu floresan moduna ayarlayın, ardından mantar gövdelerini (MB'ler) ortalayın ve odaklayın. 20X'e ayarlayın, yeniden ortalayın ve odaklanın.
   3. Drenaj aparatını drenaj havuzunun üzerine yerleştirin, drenaj şöntünün yüksekliğini, uç havuzun hemen üzerinde olacak şekilde ayarlayın ve yeterli drenajı sağlamak için Ringer solüsyonunu 30 saniye çalıştırın.
   4. Cihazı ışıktan korumak için kalkanı aşağı çekin. Foton görüntüleyicideki otomatik sistemi kullanarak, odakta ince ayarlamalar yapın ve MB'lerin referans floresan görüntüsünü alın.
3. Kayıt
   1. {{}}Foton hızını istenen kayıt hızına ayarlayın (50 msn'den 1 saniyeye veya daha fazla). Foton modunu seçin ve deklanşörü açın. Günlük girişlerinde genotip, cinsiyet, yaş ve numune numarasını kaydedin. ROI (İlgilenilen bölge) kutularının kaliks ve hücre gövdeleri (CCB) ve medial loblar üzerindeki konumunu, ROI kutularına tıklayarak ve kontrolü tutarken sürükleyerek ayarlayın.
   2. Taban çizgisini yaklaşık 5 ila 10 dakika boyunca kaydedin (istendiği gibi).
   3. 1 dakika boyunca nikotin uygulayın. Günlükte başlat/durdur notunu düşürün. Ringer solüsyonu ile 5 dakika yıkayın.
   4. Kurtarma için 5 dakika bekleyin ve KCl (potasyum klorür) günlük girişi ve zamanlayıcıyı hazırlayın.
   5. KCl'yi 1 dakika boyunca uygulayın. Günlükte başlat/durdur notunu düşürün. Ringer solüsyonu ile 1 dakika yıkayın.
   6. Floresan moduna geçin, son floresan görüntüsünü alın ve Ringer'ın solüsyonunu kapatın.
   7. "Durdur" a basın. Bir iletişim kutusu, sistemi kapatmak isteyip istemediğinizi soracaktır. Kayda devam etmek için "Hayır"ı seçin.
   8. Kalkanı açın, drenaj sistemini hareket ettirin, lens objektifini 5X'e getirin ve perfüzyon tüpünü çıkarın. Örnek/kayıt kabını sahneden çıkarın ve lensi suyla iki kez durulayıp silerek 20X lensi temizleyin.
   9. Bir sonraki kaydı başlatmak için program penceresinin üst kısmındaki beyaz oynat düğmesine basın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Calcium chloride	Merck	1023911000 style=
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Potasyum klorür	Prolabo	26 764.298
Magnezyum klorür	Prolabo	25 108.295
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine<	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat
Benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
Pipet uçları	Corning Incorporated	4868	100-1000μL Univesal Pipet Ucu
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (-80°C'ye soğutulur)
Microscope	Nikon	N/A	Eclipse-E800
Daldırma objektif lens	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
Floresanslı diseksiyon mikroskobu	Leica MZ Fl III	N/A<
Peristaltic pump	Gilson	N/A<
Tubing	Fisher Scientific	Nitrogen	Tygon R3603, St-Gobain
Perfusion system	Warner	64-0135 (VC-66CS)	Perfüzyon valfi kontrol sistemi, eksiksiz, sıkıştırma valfleri ile, 6 kanal
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
Measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A<
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A<
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
Virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/

col style='width:25%;' width='165'>'td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Sigma-Aldrichtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Leica diseksiyon kapsamı ve floresan lambatd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Minipuls 2td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380