Bir Zebra Balığı LarAva'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Hedeflenen Nöronal Ablasyon

Özet

Source: Muto, A., et al. İki Fotonlu Lazer Kullanılarak Bir Nöronal Popülasyonun Ablasyonu ve Zebra Balığı Larvalarında Kalsiyum Görüntüleme ve Davranışsal Kayıt Kullanılarak Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)

p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'>Bu videoda, agarozla hareketsiz hale getirilmiş zebra balığı larvalarında floresan nöronların seçici olarak yok edilmesini sağlayan iki fotonlu bir lazer ablasyon prosedürü gösterilmektedir. İşlemden önce ve sonra yüksek çözünürlüklü görüntüleme, floresan yokluğunda gözlemlendiği gibi verimli nöronal hasarı doğrular.

Protokol

1. İki Fotonlu Lazer Mikroskobu Kullanarak Bir Alt Nöron Alt Popülasyonunun Ablasyonu

1. Çalışılacak belirli nöronları ve UAS:EGFP veya UAShspzGCaMP6'ları etiketleyen bir Gal4 çizgisinin eşleşmesini ayarlayarak başlayın. nacre arka planını kullandığınızdan emin olun, böylece nacre homozigotlar elde edilebilir.
   NOT: ='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>nacre vücut yüzeyinde melanofor içermez (Şekil 1B). Bu çalışmada, bir Gal4 hattı gSAIzGFFM119B (pretektumu etiketler) ve başka bir Gal4 hattı hspGFFDMC76A (ILH'yi (hipotalamus Lobunu etiketler) kullanılmıştır.

2. Çiftleşme kurulumunun ertesi günü, zebra balığı yumurtalarını toplayın ve onları larva aşamasına yükseltin, bu noktada ilgilenilen nöronlar floresan raportörleri ifade edecektir.

3. Zebra balığı larvalarını %2 düşük erime noktalı agaroza monte edin (Şekil 1B).

1. %2 agaroz stok çözeltisi hazırlayarak başlayın: 2 g düşük erime noktalı agaroz tozunu 100 mL sistem suyunda çözün ( yani, dolaşan bir su sisteminde yetişkin zebra balığını korumak için kullanılan su) veya E3 suyu, suyu bir mikrodalgada kaynama noktasına getirerek ve kuvvetlice karıştırarak.

   1. %2 düşük erime noktalı agaroz stoğunu kaynayana kadar mikrodalgada ısıtın. 3.5-4.0 mL agarozu 6 cm'lik bir Petri kabının kapağına dökün. Devam etmeden önce agarozun soğumasını bekleyin, böylece dokunulamayacak kadar sıcak olur.

   2. Ardından, agaroza tek bir larva (bu adımda anestezi uygulanmamış) yerleştirin. Larvaların uygun şekilde konumlandırılmasını sağlamak için agaroz katılaşana kadar bir diseksiyon iğnesi (Şekil 1C) kullanarak larvaların konumunu ve yönünü dik olacak şekilde ayarlamaya devam edin.
      NOT: Agaroz katılaşırken larva etrafta yüzmeye devam edecektir.

   3. Larva yerleştirildikten sonra, agarozun tamamen katılaşması için 5 dakika bekleyin.

   4. Agarozun üzerine 5 mL trikain solüsyonu (1x çalışma konsantrasyonunda %0,4) dökün.
      NOT: Lazer ablasyon sırasında larvaların hareketlerini önlemek için, larvalar ablasyon prosedürü boyunca uyuşturulmalıdır.

4. İki fotonlu lazer mikroskobu sisteminde ağartma işlevini kullanarak larvayı kesin.

1. Agaroza gömülü larvaları iki fotonlu lazer tarama mikroskobunun altına yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın.

2. Görüntü alma yazılımını başlatın ve lazeri açmak için "Lazer" sekmesindeki "Açık" düğmesine tıklayın (Figure 1D). Lazerin "Durumu"nun "Meşgul"den "Mod kilitli"ye değişmesini bekleyin.

3. "Kanallar" sekmesinde, lazerin dalga boyunu EGFP (Gelişmiş Yeşil Floresan Protein) ablasyonu için 880 nm (maksimum güç: yaklaşık 2.300 mW) veya GCaMP ablasyonu için 800 nm (maksimum güç: yaklaşık 2.600 mW) olarak ayarlayın.

4. Lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 20X objektif lensini seçin. "Bul" sekmesine tıklayın, optik yolları değiştirmek için "GFP"ye (Yeşil Floresan Protein) tıklayın ve floresanı doğrudan gözle görüntüleyin.

5. Görüş merkezinde zebra balığı larva beynini bulun; ardından iki foton mikroskobuna geri dönmek için "Edinme" sekmesine tıklayın.

6. 'Ablasyondan önce' koşulunun bir kaydı olarak, 20X objektif lensiyle yüksek bir tarama hızında (ısı hasarını önlemek için) bir z-yığını görüntüsü alın. Daha sonra ablasyon deneylerinden önce ve sonra çekilen görüntüleri karşılaştırın (Şekil 2A). Bir z-yığını elde etmek için, z-yığını seçeneğini seçmek ve sekmeyi genişletmek için "Z-Yığını"na tıklayın. Larva beyninin ventral ucuna odaklandıktan sonra alt sınırı ayarlayın ("Önce Ayarla" düğmesine tıklayın) ve beynin dorsal en yüzeyine odaklandıktan sonra üst sınırı ayarlayın ("Sonuncuyu" düğmesine tıklayın). Ardından, z-stack görüntü alımını çalıştırmak için "Denemeyi Başlat" düğmesini tıklayın.

7. Lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 63X objektif lensini seçin.

8. Epi-floresan mikroskobuna geçmek için "Bul" sekmesine tıklayın, gözün görüş merkezinde kesilecek hücreleri bulun, ardından lazer tarama mikroskobuna geri dönmek için "Edinme" sekmesine tıklayın.

5. "Edinme Modu" sekmesinde, "Çerçeve Boyutu"nu 256 x 256 olarak ayarlayın. "Canlı" yı tıklayın ve ilgilendiğiniz nöronları gözlemleyin.

6. En sırt tarafından başlayarak, ablasyon yapılacak hücrelerin odakta olduğu bir odak düzlemi bulun.

7. "Bölgeler" işlevini kullanarak her nöronda hücre boyutunun yaklaşık üçte biri kadar küçük, dairesel bir alanı ilgi alanı (ROI) olarak işaretleyin.

8. Tarama hızını 13,93 s/256 x 256 piksel (134,42 μm x 134,42 μm) olarak ayarlayın, bu da yaklaşık 200 μs/piksel veya 200 μs/0,5 μm'lik bir lazer bekleme süresine karşılık gelir. Ayrıca, 4 tekrar ayarlayın ('Yineleme döngüsü: 4'). Alternatif olarak, yeterli ablasyon elde etmek için yineleme sayısını ve tarama hızını optimize edin.

9. Numuneyi (ablasyondan önce ve sonra) ve 'Bölgeler'i (ROI'leri ayarlamak için) veya kullanılan yazılımdaki eşdeğer işlevleri görüntülemek için 'Zaman serisi (2 döngü)' ile birlikte ablasyon için 'Ağartma' işlevini gerçekleştirin (Şekil 1D).

10. Zaman serisi döngüsünde ilk görüntüyü (ablasyondan önce) ve ikinci görüntüyü (ablasyondan sonra) karşılaştırarak, ağartmadan sonra hedeflenen hücrelerdeki floresansın arka plan seviyesinde gözlemlenene düştüğünden emin olun (Şekil 2B).

11. Ablasyondan sonra floresan hala mevcutsa, yineleme sayısını artırın.

12. Ardından, odak düzlemini biraz daha derine taşıyın (i.e., ventral tarafa doğru) ve ablasyona uğramamış hücrelerin göründüğü bir sonraki odak düzlemini seçin.

13. Ağartma işlevini gerçekleştirin. İlgilenilen nöral yapıdaki tüm hücreler kesilene kadar bu adımları tekrarlayın.

14. Ablasyon yapılacak nöral yapıları kaplayan tüm odak düzlemlerinden geçtikten sonra, hücrelerde kaldırılmış floresan olup olmadığını kontrol edin. Yetersiz ablasyon nedeniyle bazı hücrelerin hala floresan olduğu tespit edilirse, yukarıda açıklandığı gibi tekrar lazerle ışınlayın.

15. Lazer ışınlamasından sonra larvanın agarozdan geri kazanılması gerekiyorsa, larvaya zarar verebileceği için onu agarozdan zorla çıkarmaya çalışmayın. Bunun yerine, larvanın etrafındaki agarozda vücudunun yüzeyine dik olarak dikkatlice küçük kesikler yapın. Ardından, anestezik yıprandığında larvaların agarozdan kendi kendine yüzmesini bekleyin.

16. Ablasyon için bir sonraki larvaya geçin veya araştırılan davranışa dahil olmayan başka bir nöron popülasyonu kullanarak kontrol deneyleri yapın.
    NOT: Burada, kontrol olarak, UAS:EGFP'deki koku soğanı nöronları; gSAIzGFFM119B larvaları, yukarıda açıklanan aynı protokol kullanılarak lazerle ablasyon edildi (Şekil 2A, sağ).

17. Ca görüntülemeye veya davranışsal kayda geçmeden önce kurtarma için birkaç saat veya 1 gün bekleyin. Bu iyileşme süresi boyunca larva sağlığını kontrol edin (i.e., normal spontan yüzme, ablasyonlu alanın çevresinde belirgin bir ısı hasarı yok, etc.) ve herhangi bir belirti gösteren larvaları çıkarın sağlıksız.

Sonuçlar

Malzemeler

https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/<

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NuSieve GTG Agarose	Lonza	Cat.#50080	düşük erime sıcaklığı agarozu
6 cm petri kabı	FALCON	Product#:351007
diseksiyon iğnesi	AS ONE Corporation	Kedi. No. 2-013-01<
LSM7MP	Carl Zeiss		iki fotonlu lazer tarama mikroskobu
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63X objektif lens
Imager.Z1	Carl Zeiss		an epi-fluorescence microscope
ZEN	Carl Zeiss		Konfokal mikroskoplar için görüntü alma yazılımı
Secure-Seal Hibridizasyon Odası Contası, 8 odacık, 9 mm çap x 0,8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Ca imaging'de kayıt odası olarak kullanılır
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5	Davranışsal bir kayıt odası olarak kullanılır
Surgical knife	MANI	Oftalmik bıçak MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	model:C11440-22CU	a scientific CMOS kamera
HCImage	Hamamatsu Photonics		image acuisition software
Sabit Disk Kayıt modülü	Hamamatsu Photonics		Film dosyalarının kısa sürede bir sabit disk sürücüsüne kaydedilmesini sağlayan bir yazılım modülü
SZX7	Olympus		stereoskop
DF PL 0.5X	Olympus		SZX7 için objektif lens
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Sistemleri A.Ş.	Product No. GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS camera
XIMEA xiQ camera	XIMEA	Product No. MQ042RG-CM	CMOS camera
Bir halka LED ışık	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Naylon örgü 32μm	Tokyo Screen	N-No.380T<
Naylon örgü 13μm	Tokyo Screen	N-No. 508T-K<
Metal seive 150 mikron diyafram	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 mikron diyafram açıklığı	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd.		kuru bira mayası
LabVIEW	National Instruments		an integrated development environment for programming
Mai-Tai HP	Spectra Physics		iki fotonlu lazer

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>tr style='height:21px;' >