Caenorhabditis elegans Nöronlarında PolyQ Protein Agregasyonunun Floresan Ömür Boyu Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Pigazzini, M. L., et. al. Yaşlanmada Amiloid Yapıların Karakterizasyonu C. elegans{{}}. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, C. elegans nöronlarında poliQ protein agregasyonunu değerlendirmek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunun (FLIM) kullanımını göstermektedir, kontrol ve şaperon protein eksikliği olan solucanları karşılaştırır. Şaperon eksikliği olan solucanlarda artan agregasyon, kümelenmiş floroforlar arasında enerji transferini teşvik ederek floresan ömrünü azaltır. FLIM tarafından oluşturulan renk kodlu haritalar, deney grupları arasındaki toplama düzeylerini vurgulayarak bu farklılıkları gösterir.

Protokol

1. FLIM verilerinin elde edilmesi

NOT: Bu protokolde, floroforun ömrü zaman alanlı TCSPC yöntemi ile elde edilir. FLIM, lazer tarafından belirli ve sabit bir tekrarlama hızında bir ışık darbesi üretilmesini gerektirir. Tekrarlama oranı lazer tipine göre değişir ve kullanıcı tarafından bilinmesi gerekir. Ömür boyu ölçümler, geleneksel bir mikroskobun yanına monte edilen dedektörler ve elektronik ekipmanlarla elde edilir. Bu protokolde, mRFP, CFP ve YFP ömürlerinin elde edilmesi için sırasıyla iki farklı firma (Table of Materials) tarafından sağlanan dedektörler ve yazılımlar ile üç farklı lazer taramalı konfokal mikroskopta ölçümler yapılmaktadır. Başlamadan önce doğru emisyon/uyarma filtrelerinin yerinde olup olmadığını kontrol edin ve arka planı veya monitör arka ışığını en aza indirin. Herhangi bir deneye başlamadan önce, seçilen floroforun fotostabilitesini belirleyin. Florofor, nematod dokuları içinde kısa bir süre içinde ağarırsa, C. elegans.

1. FLIM edinme yazılımını açın. FLIM yazılımı ayrıca konfokal mikroskobun kontrolüne izin verir. Dedektör çıkışlarının etkinleştirilmesine izin vermek için sekmeyi/düğmeyi bulun ve Çıkışları Etkinleştir tuşuna basın.
2. Enstrümantal kurulumun zamanlama hassasiyetini tanımlayan enstrüman yanıt fonksiyonunu (IRF) edinin.
   NOT: Bu adım, tercihen nematodları monte etmeden önce gerçekleştirilmelidir.
   1. Varsa, uyarma/emisyon filtrelerini çıkarın.
   2. Objektifin üzerine boş bir lamel yerleştirin ve yüzeyini bulun. Lamelden elde edilen saçılma sinyalini en az 30 sn boyunca kaydedin.
      NOT: Birkaç nanosaniyelik kullanım ömrü boyunca, edinme yazılımı IRF kaymasını otomatik olarak tahmin edebilir. Bir IRF edinmek her zaman tavsiye edilir.
3. Slaytı, monte edilmiş C. elegans ile sahne alanına yerleştirin. İletim modunda 10x büyütme lensi kullanın ve nematodların slayt üzerindeki konumunu belirleyin.
4. Sürgüyü çıkarın, objektifi 63x büyütme merceğine geçirin ve gerekli daldırma ortamını (örn. yağ) uygulayın. Sahnedeki slaydı değiştirin ve nematodları lokalize edin.
5. Edinme yazılımında İğne Deliği Yöneticisi bulun ve Maximum. Örneği taramaya başlayın, ilgilendiğiniz bir bölge seçin (örn. baş, üst gövde) ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın.
6. Lazer nabız hızını ve yazılımın arayüzünde bulunan diğer üç değeri izleyin: Sabit Kesir Ayırıcı (CFD), Genlik Süresi (TAC) ve Analogdan Dijitale Dönüştürücü (ADC).
   NOT: Lazerin maksimum kapısı 1 x 10⁸ olmalıdır. Bu sayı, lazer tarafından sağlanan maksimum foton sayısını temsil eder. CFD, dedektör tarafından lazer darbesine atıfta bulunarak tek foton darbesinin alınması hakkında bilgi sağlar. Bu değer kabaca 1 x 10⁵ olmalıdır. TAC, bir fotonun tespit edildiği zaman ile bir sonraki lazer darbesi arasında ayrım yapar. Son olarak, ADC, TAC voltajını depolanabilir bir bellek sinyaline dönüştürür. Florofor tarafından yayılan fotonların kaybolmamasını sağlamak için CFD, TAC ve ADC'nin tümü benzer değerlere sahip olmalıdır. Bu parametrelerin doğru değerlendirilmesi, doğru bir yaşam süresi haritası oluşturmak için yeterli fotonun toplanmasını sağlar.
7. FLIM yazılımının arayüzünde, algılanan foton sayısını önizleyin: ADC değeri 1 x 10⁴ ve 1 x 10⁵. Gerekirse, odağı farklı bir düzleme kaydırın veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırın.
   NOT: Genel olarak, saniyede kaydedilen foton sayısı lazerin tekrarlama hızının %1'ini geçmemelidir.
8. Menü çubuğunda, alım parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek foton algılamaya izin vermek için tarama senkronizasyonunu seçin.
9. Alımı sabit bir süreye veya sabit bir foton sayısına ayarlayın. Örneğin, 2 dakika boyunca veya tek bir piksel 2.000 tek olaydan oluşan bir foton sayısına ulaşana kadar bir ömür boyu bozunma eğrisi elde edin. Alıma başlamak için Start tuşuna basın.
   NOT: Farklı floroforlar, farklı uyarma ve emisyon lazerleri ve filtreleri gerektirecektir. Numunenin parlaklığına göre, lazer gücü de ayarlanabilir, bu da kullanım ömrüne müdahale etmez. Bu protokoller aşağıdaki uyarma/emisyon ayarlarını kullanır: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. ex800/em440 nm kullanılarak CFP ölçümleri için darbeli iki fotonlu lazer kullanıldı. Bir FLIM haritasının elde edilmesi için gereken zaman ve foton sayısının, her kurulum ve her deneysel amaç için ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir.

2. FLIMfit yazılımı kullanılarak FLIM verilerinin analizi

NOT: Imperial College London'da geliştirilen FLIMfit yazılım aracını kullanarak veri analizi yapın (bkz. Şekil 1).

1. Yazılımı açın ve FLIM veri dosyalarını Dosya | FLIM verilerini yükle. Farklı oturumlarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilmiş olsa bile, tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.
2. Gerekirse, Segmentasyon | Segmentasyon Yöneticisi. Kırpma aracını, vurgulanana kadar ilgilenilen alanın etrafında sürükleyin. Tamamlandığında, OK tuşuna basın.
   NOT: Tüm görseller için segmentasyon yapılmalıdır.
3. C. elegans} (Şekil 1, Oklar 1). Bu bölgenin bozunma eğrisi, arayüzün sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünecektir (Şekil 1, Ok 2).
   NOT: Bozunma doğrusal veya logaritmik olarak görüntülenebilir.
4. Adım 2.5-2.8'de açıklandığı gibi yazılımın algoritması aracılığıyla kullanım ömrünü tahmin etmek için doğru parametreleri ayarlayın.
5. Data sekmesinde (Şekil 1, Ok 3):
   1. Integrated Minimum değerini belirleyin. iyi uyum. C. elegans örneğine bağlı olarak bu değer 40-300 arasında değişir. Tatmin edici bir önizleme elde edilene kadar farklı değerler girin.
   2. Bir Time Min ve bir Time Max sayısını seçin. Bu eşikten önce ve sonra görünen tüm etkinlikler hariç tutulur.
      NOT: Örneğin, mRFP analizi için 800 ps'den önceki ve 4.000 ps'den sonraki olaylar hariç tutulmuştur. Bu değerler floroforun kullanım ömrüne bağlıdır ve son kullanıcı tarafından belirlenmesi gerekir.
   3. Counts/Photon 1 ön ayarını değiştirmeyin.
   4. Alım sırasında kullanılan lazerin Tekrarlama Oranı değerini MHz cinsinden girin.
      NOT: Mevcut protokol için çeşitli tekrarlama oranlarına sahip farklı lazerler kullanılmıştır. CFP ömürlerinin elde edilmesi için kullanılan iki foton lazer, 80 MHz'lik bir tekrarlama oranına sahiptir, YFP için lazer 40 MHz'de tekrar eder ve mRFP için değer 78.01 MHz'dir. Bu değerler, analiz edilen örneğe göre FLIMfit'e girildi.
   5. Tüm doygun pikselleri hariç tutmak için bir Gate Max değeri girin.
      NOT: C. elegans, bu değer herhangi bir büyük sayıya ayarlanır (örneğin, 1 x 10⁸).
6. Lifetime sekmesinde, kullanılacak genel bir bağlantı elemanı seçin (örneğin, piksel bazında bir uydurma). Bkz. Şekil 1, Ok 4.
   NOT: Bir Piksel açısından uydurma, her bir piksele takılan bir bozulma üretecektir. Görüntü açısından uydurma, her bir görüntü için genel bir uyum sağlar ve görüntü başına tek bir yaşam boyu değer görüntüler. Global-wise uydurma, tüm veri kümesi boyunca tek bir uydurma oluşturur. Tüm görüntüler için tek bir yaşam boyu değeri sağlanır.
7. Hayır dışında başka bir parametreyi değiştirmeyin. Exp seçimi, seçilen floresan bozunmasının çok üstel olduğu ve tek bir ömürden daha fazlasını sergilediği biliniyorsa.
   NOT: Mevcut protokolde, bu fonksiyon biüstel CFP floroforunun ömürlerini hesaplamak için kullanılmıştır.
8. IRF'yi IRF menüsü aracılığıyla yükleyin: IRF | IRF yükleyin. IRF kaymasını tahmin etmek için IRF | IRF Kaymasını Tahmin Edin. IRF sekmesinde otomatik olarak bir değer kümesi görünür. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin.
9. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra Fit Dataset (Şekil 1, Ok 5). Algoritma, bozunma eğrisi için bir uyum üretecek ve her görüntü için bir ömür boyu değer oluşturacaktır.
   NOT: Mavi bir çizgiyle vurgulanan sonuçta ortaya çıkan uyum, tüm olaylarla örtüşmelidir. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir.
10. Parametreler sekmesine tıklayın (Şekil 1, Ok 6), ve Statistic: w_mean (ağırlıklı ortalama) ve chi2{{ TAG_598}} değeri 1'e mümkün olduğunca yakındır.
    NOT: chi2 birbirine yakın bir ton, uyumun doğruluğunu sağlar. Seçilen görüntünün yaşam boyu değeri böylece tau_1 olarak ortaya çıkar.
11. İlgilendiğiniz herhangi bir bilgiyi dışa aktarın: Dosya | Yoğunluk Görüntülerini Dışa Aktar/Sonuç Tablosunu Sığdır/Görüntüler/Histogramlar. Kullanım ömrünü hesaplamak için kullanılan veri ayarlarını kaydedin: Dosya | Veri Ayarlarını Kaydet.
    NOT: Kullanılan parametreler, seçilen örneklerin gelecekteki analizi için kaydedilecektir.

3. FLIM verilerinin grafiksel gösterimleri

NOT: Farklı örneklerden toplanan ömürler, çeşitli şekillerde görsel olarak temsil edilebilir. Yaşam süresi değerlerini nanosaniye veya pikosaniye cinsinden belirtmek için seçin.

1. Bozunma eğrisini doğrudan FLIMfit'ten dışa aktararak uyumun kalitesini ve eğrinin doğruluğunu gösterin.
2. Bir histogramdaki foton sayısının frekansını yaşam süresi değerine karşı çizerek fotonların dağılımını temsil edin.
3. Son olarak, istatistiksel karşılaştırma için, iki veya daha fazla örneği karşılaştırıyorsanız, yaşam süresi değerlerini ve ortalamanın standart sapmasını bir dağılım grafiği çubuk grafiğine yerleştirin. İstenilen herhangi bir istatistiksel analizi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Malzemeler