Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

Özet

Kaynak: Kulkarni, M. et al. Fare retinasının koni fotoreseptörü akson terminallerinde Ca²⁺ dinamiği. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, transgenik bir fare retinasının koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini izlemek için iki foton mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Arka plan aydınlatması ve ışık stimülasyonu altında kalsiyum seviyelerini ölçmek için retina dilimleri hazırlama, FRET tabanlı kalsiyum biyosensörlerini görüntüleme ve floresan değişikliklerini analiz etme adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Dilim hazırlama (10 - 15 dakika)
   1. Retina dilimleme için nitroselüloz filtre membranlarını ve dilimleri monte etmek ve kayıt odasına aktarmak için cam lameller hazırlayın. Nitroselüloz filtre membranını makas kullanarak yaklaşık 10 x 5 mm boyutunda dikdörtgen parçalar halinde kesin. Lamelleri bir cam kesici kullanarak yaklaşık 10 x 5 mm boyutunda dikdörtgen parçalar halinde kesin.
   2. Bir cam slaytı yavaşça dokuya yakın hücre dışı çözeltiye daldırın. HR2.1:TN-XL Ca²⁺ biyosensör fareden elde edilen retina dilimini, bir çift forseps kullanarak en kenarından tutarak ganglion hücresi yukarı bakacak şekilde cam kızağın üzerine nazikçe çekin. Bu işlem mekanik hasarı ve dokunun katlanmasını azaltır.
   3. İlgili araştırma sorusuyla ilgili retina bölgesini seçin. Kavisli bir neşter bıçağı kullanarak seçilen retina bölgesinden dikdörtgen, yaklaşık 1 x 2 mm'lik bir parça kesin. Dokunun etrafındaki fazla solüsyonu silin.
   4. Filtre zarını, ganglion hücre tarafı zara yapışacak şekilde retina parçasının üzerine yerleştirin. Hemen, dokuyu zara sıkıca bağlamak için zarın üzerine bir damla hücre dışı ortam ekleyin.
   5. Membrana monte retina dokusunu taze hücre dışı solüsyon içeren dilimleme odasına aktarın.
   6. Bir doku kıyıcıya bağlı yeni bir tıraş bıçağı kullanarak retinayı 200 μm kalınlığında dikey dilimler halinde kesin (Şekil 1B). Her retina parçası için bıçağı değiştirin.
      Not: Tıraş bıçağının, kesme sırasında bir "klik" sesiyle gösterildiği gibi, tüm zar aynı anda ayrılacak şekilde dilimleme haznesi tabanının yüzeyi ile mükemmel bir şekilde hizalanması gerekir. Aksi takdirde, bıçak bükülebilir ve dilime zarar verebilir.
   7. Membrana monte edilmiş tek bir dilimi, yalnızca membran uçlarına yüksek vakumlu gres uygulayarak bir cam lamele yapıştırın (Şekil 1C). Retinanın altındaki cam yüzeyi yağdan uzak tutun.
   8. Lameli monte edilmiş dilimleri, oda sıcaklığında (RT) bir karbonhidratoksijen atmosferi altında - kapalı ve ışık geçirmez bir kap, örneğin kapağı alüminyum um folyo ile kaplı bir Petri kabı - tutma odasında bir damla hücre dışı çözelti ile kaplanmış halde tutun. Tutma odasındaki atmosferi nemli tutmak için küçük bir su haznesini köpürterek karbonhidrat ekleyin; Bu, dilimlerin kurumasını önler.
   9. Dilimleri (teker teker) kayıt odasına taşımadan önce 10 - 15 dakika bekletme odasında dinlendirin. Dilimler, RT'de (~21 °C) bir tutma odasında 4-5 saate kadar muhafaza edilebilir.

2. İki fotonlu Ca²⁺ Görüntüleme

1. İki fotonlu mikroskopi
   1. Hareketli Objektif Mikroskop (MOM) tipi iki fotonlu mikroskop kullanın.
      Not: Aşağıdaki minimum gereksinimleri karşılayan herhangi bir dik iki foton mikroskobu kullanılabilir: (a) ~860 nm'ye ayarlanabilen darbeli bir lazer, (b) aynı anda elde edilen en az iki floresan kanalı, (c) gelişmiş camgöbeği floresan proteini (eCFP) ve sitrin floresan için filtreler, (d) bir ışık stimülatörü ve (e) ilgilenilen Ca²⁺ sinyallerini çözmek için yeterli bir kare hızında hızlandırılmış görüntü dizilerinin kaydedilmesine izin veren yazılım.
   2. İki fotonlu görüntüleme sistemini üretici tarafından belirtildiği gibi başlatın. Tesisin lazer güvenlik yönergelerine kesinlikle uyun. Lazeri başlatın ve ~860 nm'ye ayarlayın.
   3. Bekletme odasından kayıt odasına bir dilim aktarın ve hemen karbonhidratlı hücre dışı çözelti ile perfüze etmeye başlayın. Kayıt odasında 2 ml/dk'lık bir perfüzyon akış hızını ve 37 °C'lik bir sıcaklığı koruyun.
   4. 20X 0,95 sayısal açıklık (NA) suya daldırma hedefi kullanın. Varsa, retina dilimini bulmak için kayıt odasının altında bir kızılötesi ışık yayan diyot (LED) ile birlikte bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamerası kullanın (Şekil 2). Aksi takdirde, iki fotonlu görüntüleme kullanarak dilimi bulun (bkz. 2.1.5).
   5. Biyosensör ifadesini görüntülemek için iki fotonlu görüntülemeye geçin. eCFP ve sitrinin floresan görüntülemesi için iki algılama kanalını açın.
   6. Kayıt için bir sıra koni terminalini taramak ve seçmek için iki foton mikroskobunu kontrol eden görüntü elde etme yazılımını kullanın (Şekil 3A). Görüntü alımını 128 x 16 piksel görüntü (31,25 Hz) veya benzer bir yapılandırmaya ayarlayın. Dış segmentlerdeki fotopigmentlerin ağartılmasını önlemek için taranan alanı koni terminalleriyle sınırlayın.
      Not: TN-XL kalsiyum sensörü için (Ca²⁺ bağlama için τ = ~0,6 saniye, Ca²⁺ bağlama için τ = ~0,2 saniye), minimum ~8 Hz kare hızı önerilir.
   7. Işık stimülasyonu ve kaydı
      1. Aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için bir alt aşama tam alan ışık stimülatörü kullanın.
         Not: Tam alan ışık stimülatörü için basit bir çözüm, fare konilerinin dalga boyu hassasiyetlerine uyan ancak aynı zamanda floresan algılama için kullanılan filtrelerle örtüşmeyen iki bant geçiren filtreli LED (örneğin, "mavi": 360 bant geçiren (BP) 12, "yeşil": 578 BP 10) kullanmaktır. LED'lerden gelen ışık, kondansatör tarafından kayıt odasının altından odaklanır (Şekil 2).
      2. Lazeri açın ve ışık uyaranlarını sunmadan (bkz. 2.2.3) veya farmakolojik ajanları uygulamadan önce konilerin tarama lazerine ve uyaran arka plan ışığına (20 - 30 saniye) uyum sağlamasına izin verin.
      3. Keyfi uyaranların sunumunu başlatın (örneğin, Şekil 3B, C'de gösterildiği gibi ışık çakmaları). Adım 2.2.1'de açıklanan stimülatör durumunda, özelleştirilmiş yazılım tarafından kontrol edilen bir mikroişlemci kartı kullanarak iki LED'in zaman içindeki yoğunluğunu modüle ederek uyaranları oluşturun.
      4. İki floresan kanalını kaydetmeye başlayın (örneğin, "mavi" için 483 nm'de
   8. Förster rezonans enerji transferi (FRET) verici eCFP ve "sarı" FRET alıcısı için 535 nm'de) aynı anda ilgili görüntü elde etme yazılımı kullanılarak (ayrıca bkz. 2.1.6). Örneğin, ışık yanıp sönmesi durumunda (Şekil 3B, C), en az 8 - 10 uyaran sunumu kaydedin (denemeler).

Sonuçlar

Şekil 1. Dikey retina dilimlerinin hazırlanması. (Bir) İzole edilmiş ve düzleştirilmiş retina dilimleme için hazırlanmıştır. (B) Dilimlemeden sonra filtre kağıdı zarına (koyu gri) monte edilmiş dikdörtgen retina parçası (A'dak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yüksek vakumlu gres	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Kapak fişleri	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Cam slaytlar	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Doku doğrayıcı için bıçaklar	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Doku doğrayıcı	Özel yapım
Nitroselüloz filtre membran ızgaralı	Merck Millipore	AABG01300	Filtre tipi: 0,8 μm; http://www.emdmillipore.com
UV/yeşil LED tabanlı tam alan stimülatörü	Özel yapım
Açık kaynaklı mikroişlemci kartı	Arduino		http://www.arduino.cc
Görüntüleme yazılımı CfNT	Özel olarak yazılmış		Michael Müller, Tıbbi Araştırma MPI, Heidelberg, Almanya tarafından geliştirildi
	IgorPro	Wavemetrics
perfüzyon sistemi	100 μm çaplı uç manifoldu ile	ALA Scientific Instrument
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Safir lazer)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Hareketli objektif mikroskobu (MOM), W. Denk, MPImF, Heidelberg, Almanya tarafından tasarlanmıştır	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w objektif	Olympus
http://www.olympusamerica.com Leica MZ95	Leica mikro sistemler		http://www.leica-microsystems.com/

VC3-4 Sistem odaklama http://www.wavemetrics.com; http://www.alascience.com/.