Zebra Balığı Retina Rejenerasyonu Sırasında Müller Glial Nükleer Migrasyonunun Canlı Hücre Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Lahne, M., et.al. Multifoton Mikroskobu ile Canlı Hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra Balığı Retinal Eksplantlarının Kültürü. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, ışık kaynaklı fotoreseptör hasarını takiben agaroza gömülü zebra balığı retinal eksplantlarında Muller glial nükleer göçünün canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Hasarlı fotoreseptörler tarafından salınan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), Muller glial hücrelerini aktive ederek mitoz ve nöronal progenitör oluşumu için iç ve dış nükleer tabakalar boyunca nükleer göçü tetikler. Yakalanan görüntüler, retina rejenerasyonu sırasında nükleer göç ve progenitör farklılaşmasının dinamiklerini ortaya koymaktadır.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

Çoklu Foton Mikroskobu

NOT: Bu el yazmasında gerçekleştirilen deneyler, bir kızılötesi lazer (Malzeme Tablosuna bakınız), bir 40X Apo uzun mesafeli suya daldırma objektifi (N.A. 1.15), bir galvanometre tarayıcı ve dört adet 35 mm'lik Petri kabı için bir ek içeren bir çevre odası ile donatılmış bir çoklu foton mikroskobu için optimize edilmiştir. Görüntüler, taranmamış bir dedektör (R-NDD) ile elde edildi.

1. Görüntülemeden önce,% 5 CO₂ / hava atmosferi elde etmek için çevre odasını dengeleyin. Odaya gaz sızmasını önlemek için boş Petri kaplarının tutucuya yerleştirildiğinden emin olun.
2. Mikroskopi sistemini açın.
3. Çevre odası dengelendikten sonra, 40X Apo uzun mesafeli suya daldırma hedefine (NA 1.15) kırılma indisi sıvısı ekleyin.
   NOT: Suya benzer optik özelliklere sahip kırılma indisi sıvısı, uzun süreli görüntüleme sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için kullanılır.
4. Retinal eksplantlı florotları hazneye yerleştirin. Parlak alan ışığını kullanarak, numuneyi ışık yoluna yerleştirin ve dorsal retinanın orta bölgesini odak düzlemine getirin.
5. GFP epifloresan ışığını gfap:nGFP-pozitif Müller glia çekirdeklerine odaklamak için kullanın (Şekil 1A, C).
   NOT: Eksplantlar düz bir şekilde monte edilmezse veya eksplantın altında agaroz birikirse, gfap:nGFP-pozitif çekirdeklere odaklanmak zor olacaktır veya loş bir şekilde floresan yayılırlar.
   1. Aynı retinal ekstans içinde farklı bir bölgeye geçmenin odaklanma sorununu çözüp çözmeyeceğini kontrol edin. Aksi takdirde, farklı bir retina ekstansına geçin.
6. Görüntü alma yazılımında 'A1 MP GUI', 'TiPad', 'A1 Kompakt GUI' ve 'ND alımı' pencerelerini açın. Çoklu foton görüntüleme için, 'A1 Kompakt GUI'de 'IR NDD' seçeneğinin seçildiğinden emin olun.
7. 'Ayar' alanında, 1. dikroik ayna için IR-DM'yi seçin ve GFP floresansı elde etmek için bant geçiren filtre 525/50'yi seçin.
8. 'A1MP GUI' etiketli pencerede IR lazeri açın. Lazerin hazır olması birkaç dakika sürecektir. GFP floresansını uyarmak için dalga boyunu 910 nm'ye ayarlayın ve 'A1 MP GUI' penceresindeki 'Otomatik hizalama' düğmesine tıklayarak lazeri hizalayın.
9. Fotoçoğaltıcı tüpün aşırı pozlanmasını önlemek için 'A1 MP GUI'de deklanşörü açmadan önce oda ve ekipman ışıklarının kapalı veya kapalı olduğundan emin olun. Gürültü seviyelerini azaltmak için mikroskobu karanlık bir ortamda saklayın.
10. 300 x 300 piksellik bir görüş alanının, iki yakınlaştırmada ve 4,8 μs/piksellik bir piksel bekleme süresinin görüntülerini elde edin. 'A1MP GUI'deki 'alım alanını' ve 'A1 Compact GUI' penceresindeki kazancı değiştirerek lazer gücünü kabaca ayarlayın.
11. z-stack
    1. ND alımı' penceresindeki 'z' alt penceresindeki z-yığınının üst odak düzlemini ayarlamak için ganglion hücre katmanına (GCL) odaklanın. Bazı gfap:nGFP pozitif hücreler tipik olarak ganglion hücre tabakasında bulunur ve bu da retinanın bazal sınırını tanımlamaya yardımcı olur (Şekil 1A, D).
    2. Odak düzlemini, iç nükleer katmandaki (INL) muadillerine göre yuvarlak ve genişlemiş loş etiketli gfap:nGFP pozitif hücrelerin varlığı ile karakterize edilen dış nükleer katmanın (ONL) (Şekil 1A, B) seviyesi boyunca hareket ettirin (Şekil 1A, C).
    3. Bu düzlemi z yığınının en alt kısmı olarak ayarlayın. ONL'nin tamamının görüntüleneceğinden emin olun (Şekil 1A, B).
    4. Görüntüleme süresi boyunca yeniden ayarlama gerektiren odak düzlemi kaymaları yaşarken, 'ev' konumu olarak atamak için 'z' alt penceresindeki orta konuma çift tıklayın. 'Simetrik mod tanımlı' olarak değiştirin ve 'göreceli'yi tıklayın.
    5. Z adımı boyutunu 0,7 ila 1 μm arasında ayarlayın.
12. Z-yoğunluğu düzeltmesi:
    1. Dokunun derin katmanlarında görüntüleme yaparken ışık saçılımı nedeniyle piksel yoğunluğu kaybını telafi etmek için z-yoğunluğu düzeltmeleri uygulayın.
    2. Düzeltmeyi ayarlamak için 'z-yoğunluğu düzeltmesi' penceresini açın. 'z-stack aralığını' ayarlamak için 'ND'den' öğesini seçin.
    3. 'z-yoğunluğu düzeltme' penceresindeki alt odak düzlemine tıklayın (bu durumda, ganglion hücre katmanına karşılık gelir) ve lazer yoğunluğunu ('A1MP GUI'de 'edinme alanı') ve kazancı (A1 Kompakt GUI) ayarlayın.
    4. Seçilen odak düzlemi için 'z yoğunluğu düzeltme' penceresinde 'cihaz ayarları' altında daha sonra gösterilen ayarları onaylamak için 'z yoğunluğu düzeltme' penceresindeki 'z değerleri'nin yanındaki oka tıklayın.
    5. İşlemi orta ve üst düzlemler için tekrarlayın, lazer gücünü ve kazancını artırın. Gerekirse ek odak düzlemleri eklenebilir. Şekil 1 - 1'teki deneyler için özel lazer ve kazanç ayarları için Tablo 3'e bakın.
    6. 'A1 MP GUI' penceresinde 'çekim alanını' ayarlayın. Foto ağartmayı ve artan gürültü seviyelerini atlatmak için görüntülemenin başlangıcında 15'ten büyük bir çekim alanı ve 126'dan yüksek bir kazanç seçmekten kaçının.
       NOT: Lazerler ve fotoçoğaltıcı tüpler mikroskopi sistemleri arasında farklılık gösterdiğinden, fotoağartmadan kaçınırken mikroskop kurulumu için en uygun görüntüleme koşullarını elde etmek için lazer ve kazanç ayarlarını test edin.
    7. 'z yoğunluğu düzeltmesi' penceresinde 'bağıl yoğunluk düzeltmesi'ni seçin.
13. 'ND alımı' penceresindeki 'zaman serisi' alt penceresinde, süreyi 8 saat ve aralığı 'gecikme yok' olarak ayarlayın. Ardından, 3-B zaman serisini almak için 'ND alımı' penceresi düğmesindeki 'z-stack' alt penceresindeki 'Z-düzeltmeyi çalıştır' seçeneğini tıkladığınızdan emin olun.
14. Görüntü elde etme süresi boyunca retinal eksplantları 27 - 29 ° C'lik bir sıcaklıkta tutun.
15. Görüntü alma süresi boyunca, gerekirse, görüntüleme sonrası analiz için görüntü kalitesini korumak için güç seviyesini ve kazancı yeniden ayarlayın. Ayarlamalar için 1.11.2 - 1.11.4 adımlarını gerçekleştirin.
16. Odak düzlemi kayarsa, çalışmayı duraklatın veya durdurun ve adım 1.11'i tekrar gerçekleştirin.
    NOT: Adım 1.12.7'de 'bağıl z-düzeltmesi' seçilmişse ve adım 1.11.4 gerçekleştirilmişse, kapsamlı foto ağartma meydana gelmedikçe güç ve kazanç seviyelerinin yeniden ayarlanması gerekli olmamalıdır.

Tablo 1: Şekil 1 - 3'te gösterilen deneyler için farklı düzlemlerde Z-yoğunluğu düzeltmeleri için kullanılan lazer ve kazanç seviyeleri.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	Lazer gücü	Kazanç	Lazer gücü	Kazanç
Üst (çubuk fotoreseptör)	13	126	3,5	118
Orta (Muller glia)	10	126	2,8	118
Alt (Ganglion hücre tabakası)	8	126	2,1	118

Sonuçlar

Resim 1: Retinal Multifoton Z-Yığınlarının 3 Boyutlu Rekonstrüksiyonu. A) 48 saatlik ışık hasarından sonra zebra balığından retinal tam montajlı kültürlerde gfap:nGFP- pozitif hücrelerin çoklu foton z-yığını görüntü serisinin 3 boyutlu ...

Malzemeler